榆黃蘑菌絲生長條件優化

巫桂芬，蘇 勁，梁劍柳，黃秋嬋，廖建杰，蘇美琪

（廣西民族師范學院 廣西崇左 532200）

榆黃蘑（Pleurotus citrinopileatus）是一種珍稀食（藥）用真菌，學名為金頂側耳，隸屬于擔子菌門、蘑菇目、側耳科、側耳屬[1-3]。由于其菌蓋顯草黃色或鮮黃色，所以又稱為金頂蘑或榆黃蘑，其表面光滑、呈漏斗狀，歷來有“真菌之花”的美稱。榆黃蘑味道鮮美，營養豐富，屬于高營養、低熱量的理想保健品，市場前景廣闊[4]。榆黃蘑子實體中含有豐富的活性物質，如多糖、黃酮、蛋白質、維生素等，長期食用，有抗氧化、免疫調節等藥用功能[5-7]，此外食用榆黃蘑還可預防葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎桿菌和肺結核桿菌的感染[8-10]。榆黃蘑符合聯合國糧農組（FAO）和世界衛生組織（WHO）關于新食品資源的要求，是一種高營養、低熱量、名貴的食藥兩用真菌，是老年人心血管疾病患者和肥胖癥患者的理想保健食品[11-13]。

培養基中碳源、氮源、溫度、光照度、pH 值和濕度等條件對食用菌菌絲生長有一定影響[14-16]。林鈴等[17]對榆黃蘑菌絲培養基中碳源進行篩選，但未對配方中的碳含量進行優化試驗。洪沛等[18]、Wang等[19]歸納總結了光環境三要素（光質、光照度、光照時長）對食用菌生長發育的影響及其可能的調控機制，討論了食用菌光生理研究中存在的問題。劉妮等[20]、Wu 等[21]研究發現，不同的食用菌菌絲在顏色、形態、菌絲致密程度、滿皿時間及平均生長速度等宏觀形態上有很大差異。羅瑩等[22]、Li 等[23]通過對食用菌菌絲顏色、密度、均勻度、平均生長速率和生長指數進行比較，探討了7 種不同谷物對試驗菌株菌絲生長的影響。我國南方地區關于榆黃蘑栽培的研究不多，尤其是在廣西等地對榆黃蘑菌絲生長條件研究甚少[24]。而榆黃蘑菌絲培養直接影響其產量和品質，因此，進行榆黃蘑菌絲生長條件優化尤為重要。筆者采用PDA 培養基培養菌絲，并對其生長過程所需的溫度、光照時間、瓊脂質量濃度、pH值、碳源、氮源等條件進行優化。采用正交試驗方法探究不同條件對榆黃蘑菌絲生長的影響，篩選出榆黃蘑菌絲生長最佳培養條件，以期為榆黃蘑生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為山東省平邑縣食用菌研究所提供的平頂8-31 榆黃蘑，通過組織分離純化獲得菌絲。榆黃蘑子實體菌蓋為草黃色至鮮黃色、光滑、漏斗形，邊緣內卷，直徑3.00～10.00 cm。菌肉白色，菌褶白色、密、延生、不等長。菌柄偏生、白色、內實，長2.00～10.00 cm，粗0.50～1.50 cm，往往基部相連。

1.2 主要儀器設備與試劑

立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫療設備有限公司），光照培養箱（上海慧泰儀器制造有限公司），超凈工作臺（上海蘇凈實業有限公司），電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）。

可溶性淀粉、細菌學蛋白胨、牛肉膏、檸檬酸銨、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、硝酸銨、瓊脂粉、無水乙醇、維生素B1 等試劑藥品均為分析純。

1.3 方法

試驗時間為2021 年6 月21 日至12 月21 日，地點為廣西民族師范學院崇智樓。采用完全隨機試驗設計，共設定6 個單因素處理，每個處理3 次重復，在處理后17 d 統計菌絲生長量，具體設計方案如下。

1.3.1 不同光照時間對菌絲生長的影響 以光照時間為單因素變量，光照時間分別為0、12、24 h。所有處理均采用PDA 培養基在28 ℃恒溫環境中培養，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.2 不同溫度對菌絲生長的影響 以溫度為變量，分別設定為室溫（平均溫度25 ℃）、5、28、32、35 ℃。采用PDA 培養基培養，接種完成后將各處理置于相應的培養環境中培養，記錄室內早、中、晚各時間段溫差變化，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.3 不同瓊脂質量濃度對菌絲生長的影響 以瓊脂質量濃度為變量，利用瓊脂質量濃度做梯度調節培養基的凝固程度。各處理培養基瓊脂質量濃度 分 別 為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 g·mL-1。將培養菌絲置于28 ℃恒溫環境中培養，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.4 不同pH 值對菌絲生長的影響 以pH 值為變量，各處理pH 值分別為5.00、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00、8.50。采用PDA 培養基培養，利用酸或堿調節培養基內的pH 值并置于28 ℃恒溫環境中培養，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.5 不同碳源對菌絲生長的影響 以不同碳源為變量，以PDA 培養基為CK，CK 的碳源為馬鈴薯，其余處理碳源分別為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉，處理質量濃度為0.020 g·mL-1。通過分析篩選出最適碳源，再進行碳源梯度試驗，其梯度處理分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 g·mL-1。各處理置于28 ℃恒溫環境中培養，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.6 不同氮源對菌絲生長的影響 以PDA 培養基為CK，在以上優選的碳源培養基中設計不同氮源作為變量，氮源分別為硝酸銨、檸檬酸銨、蛋白胨、牛肉膏，處理質量濃度為0.020 g·mL-1。通過分析篩選出最適氮源，再進行氮源梯度試驗，其梯度處理分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 g·mL-1。各處理置于28 ℃恒溫環境中培養，觀察菌絲濃密程度及測量菌絲生長量。

1.3.7 正交試驗驗證 根據單因素試驗結果選擇溫度為25、28、32 ℃，瓊脂質量濃度0.010、0.020、0.030 g·mL-1，牛 肉 膏 質 量 濃 度 為0.010、0.015、0.020 g·mL-1，進行3 因素3 水平的正交試驗，每個處理設置3 次重復。

1.4 數據處理

采用Excel 2010 計算菌絲各水平的平均生長量及其極差，采用SPSS 20.0 進行正交試驗以及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同光照時間對榆黃蘑菌絲生長的影響

由表1 可知，不同光照時間對榆黃蘑菌絲生長量的影響無顯著差異；但暗環境下菌絲轉色相對較快（圖1）。榆黃蘑在接種的次日菌絲復活，在9～13 d之間菌絲生長速度最快，一般在17～19 d 長滿。暗處理的菌絲長滿較光處理的菌絲快1～2 d。其中，12 h 光處理的菌絲在9～10 d 出現一次爆發性增長。從菌絲生長形態看，黑暗培養的菌絲生長相對較密，光照時間為12 h 的菌絲生長密度中等，光照時間為24 h 的菌絲較為稀疏。可見光照時間長短影響菌絲生長及轉色，而黑暗條件下菌絲生長快且平穩，后期轉色快。

圖1 不同光照時間對菌絲生長的影響（部分）Fig.1 Effect of different illumination time on hyphae growth（partial）

表1 不同光照時間對菌絲生長的影響Table 1 Effect of different illumination time on hyphae growth

2.2 不同溫度對榆黃蘑菌絲生長的影響

由圖2 可以看出，不同溫度對榆黃蘑的菌絲生長速率影響較大。試驗期間室溫日平均溫度為25 ℃；在生長前4 d 中，由于天氣降溫，室溫處理組中菌絲生長均較慢，28 ℃處理中菌絲擴散較快，室溫處理組中菌絲相對較密，35 ℃處理中菌絲旺盛，5 ℃處理中均未有菌絲生長。隨著天氣的回暖增溫，室溫處理中的菌絲生長逐漸加快，且相對較密，但在17 d 后所有處理的菌絲停止生長，原因是使用的膠塞為實心膠塞，菌絲生長到一定時間試管內的氧氣不足則菌絲出現停止生長現象。從整體上來看，室溫菌絲生長受環境溫度變化影響較大，在4～9 d 室溫環境中的菌絲生長狀況優于其他溫度處理組，試驗結果表明，崇左市當季室溫環境有利于菌絲的發菌與吃料，但總體表現為25～28 ℃最適合菌絲生長。

圖2 不同溫度對菌絲生長的影響（部分）Fig.2 Effect of different temperature on hyphae growth（partial）

由表2 可知，不同溫度對榆黃蘑菌絲日均生長量的影響存在極顯著差異。在室溫、28、32 ℃的培養溫度下榆黃蘑菌絲生長量顯著大于5 和35 ℃。室溫、28、32、35 ℃的培養溫度環境下榆黃蘑菌絲生長量極顯著大于5 ℃。

表2 不同溫度對菌絲生長的影響Table 2 Effect of different temperature on hyphae growth

2.3 不同瓊脂質量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響

由圖3 和表3 可知，不同瓊脂質量濃度對榆黃蘑的菌絲日平均生長量及生長速率有一定的影響。不同瓊脂質量濃度梯度試驗中，質量濃度低則試管環境濕度大，質量濃度高則試管相對濕度低。從各處理來看，接種后3 d，0.01～0.06 g·mL-1處理均有菌絲生長，0.07、0.08 g·mL-1未見菌絲生長，其中，0.01 g·mL-1處理組均有菌絲生長及擴散；0.02、0.03 g·mL-1處理也有菌絲生長，但相對較慢；而0.04、0.06 g·mL-1處理中只有部分試管有菌絲生長。接種后6 d，0.04、0.05、0.06 g·mL-1處理中的菌絲生長相對較好；0.03～0.06 g·mL-1處理中接種部位菌絲生長密集形成類似球狀，其中0.03 g·mL-1處理中菌絲相對較為稀疏，0.04～0.06 g·mL-1處理中菌絲相對濃密。結果表明，試管內的濕度對菌絲生長影響表現為濕度越高菌絲生長越快，菌絲稀疏；濕度越低菌絲生長越慢，菌絲濃密。

圖3 不同瓊脂濃度對菌絲生長的影響（部分）Fig.3 Effect of different agar concentration on hyphae growth（partial）

表3 不同瓊脂質量濃度對菌絲生長的影響Table 3 Effect of different agar concentration on hyphae growth

由表3 可知，不同瓊脂質量濃度對榆黃蘑菌絲日均生長量的影響呈極顯著差異。0.01～0.04 g·mL-1的瓊脂培養的榆黃蘑菌絲生長量顯著大于0.05～0.08 g·mL-1，0.01～0.06 g·mL-1的瓊脂培養的榆黃蘑菌絲生長量極顯著大于0.07～0.08 g·mL-1。

2.4 不同pH值對榆黃蘑菌絲生長的影響

由圖4 和表4 可知，pH 值在5.00～8.50 之間對榆黃蘑菌絲生長的影響表現為前期影響小、后期影響變大。在制備培養基的過程中，pH 值越高，培養基中的瓊脂凝固得越快，反之則不易凝固。在接種后3 d，pH 6.00、6.50、7.00、7.50 處理中的接種部位菌絲生長較密。而在接種后12 d，pH 6.50 處理中的菌絲均已長滿培養基，其他處理的菌絲還未長滿。接種后15 d，pH 5.50、6.00 處理中菌絲均長滿培養基，pH 7.00、7.50、8.00、8.50 處理中菌絲均長滿培養基且長出培養基外。

圖4 不同pH 值對菌絲生長的影響（部分）Fig.4 Effect of different pH on hyphae growth（partial）

表4 不同pH 值對菌絲生長的影響Table 4 Effect of different pH on hyphae growth

由表4 可知，不同pH 值對榆黃蘑菌絲生長的影響無顯著差異。pH 值在5.00～8.50 范圍內，雖培養基瓊脂凝固程度受pH 值的影響，但對菌絲生長并無顯著影響。

2.5 不同碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響

2.5.1 碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響 由表5 和圖5 可知，不同碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響無顯著差異。碳源為淀粉時，榆黃蘑菌絲日平均生長量最大，為0.83 cm。碳源為蔗糖時，榆黃蘑菌絲日平均生長量為0.79 cm。其次是CK、葡萄糖和麥芽糖。后續試驗選取菌絲日平均生長量最大的淀粉作為碳源的梯度試驗。

圖5 不同碳源對菌絲生長的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on hyphae growth

表5 不同碳源對菌絲生長的影響Table 5 Effect of different carbon sources on hyphae growth

2.5.2 淀粉質量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響

由表6 和圖6 可知，不同淀粉質量濃度對榆黃蘑的菌絲生長影響較小。接種后5 d，0.005 g·mL-1淀粉處理的培養基表面菌絲顏色淺；0.010 g·mL-1淀粉處理的培養基表面菌絲均變白；0.015 g·mL-1淀粉處理的菌絲顏色淺；0.020 g·mL-1淀粉處理的菌絲較為稀疏；0.025 g·mL-1淀粉處理的菌絲顏色較淺；0.030 g·mL-1淀粉處理的菌絲長勢相對較強；0.035 g·mL-1淀粉處理的菌絲相對較密。以上各處理菌絲長滿培養基后，菌絲生長情況均無明顯區別，通過單因素方差分析得知，不同淀粉質量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響無顯著差異。

圖6 不同淀粉質量濃度對菌絲生長的影響（部分）Fig.6 Effect of different starch content on hyphae growth（partial）

表6 不同淀粉質量濃度對菌絲生長的影響Table 6 Effect of different starch content on hyphae growth

2.6 不同氮源對榆黃蘑菌絲生長的影響

2.6.1 氮源篩選 由表7 和圖7 可知，不同氮源對榆黃蘑菌絲生長有選擇性作用。培養基的氮源為牛肉膏時，榆黃蘑菌絲日平均生長量最大，為0.68 cm；其次是CK、蛋白胨、硝酸銨和檸檬酸銨。而檸檬酸銨對榆黃蘑菌絲生長具有抑制作用，因此，以牛肉膏作為榆黃蘑培養的最佳氮源。通過單因素方差分析得知，不同氮源對榆黃蘑菌絲生長的影響存在極顯著差異。

圖7 不同氮源對菌絲生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on hyphae growth

表7 不同氮源對菌絲生長的影響Table 7 Effect of different nitrogen sources on the growth of hyphae

2.6.2 牛肉膏質量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響 由圖8 和表8 可知，不同牛肉膏質量濃度影響榆黃蘑菌絲的生長。接種后2 d，牛肉膏質量濃度由低到高的培養基依次陸續有菌絲長出。接種后5 d，0.020～0.035 g·mL-1牛肉膏處理中，起初生長出來的菌絲出現被溶解的假象。接種后9 d，0.020～0.035 g·mL-1牛肉膏處理中，再次出現白色菌絲，逐漸變密。接種后16 d，0.005 g·mL-1牛肉膏處理中的菌絲最早長滿培養基，其他依次為0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 g·mL-1。試驗結果表明，過量的氮源會抑制榆黃蘑菌絲的生長，待菌絲對生長環境調整適應后又開始陸續生長、變密。

圖8 不同牛肉膏質量濃度對菌絲生長的影響（部分）Fig.8 Effect of different beef extract contents on hyphae growth（partial）

表8 不同牛肉膏質量濃度對菌絲生長的影響Table 8 Effect of different beef extract contents on hyphae growth

不同牛肉膏質量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響存在顯著差異。0.015、0.020 g·mL-1牛肉膏處理的榆黃蘑菌絲生長量顯著大于0.030、0.035 g·mL-1牛肉膏處理。0.010 g·mL-1牛肉膏處理的榆黃蘑菌絲生長量極顯著大于0.035 g·mL-1牛肉膏處理，而0.005、0.025 g·mL-1牛肉膏處理均與其他處理組無顯著差異。

2.7 榆黃蘑菌絲培養條件正交試驗分析

由表9 可知，根據單因素試驗結果，選擇溫度 為25、28、32 ℃，瓊 脂 質 量 濃 度0.01、0.02、0.03 g·mL-1，牛 肉 膏 質 量 濃 度 為0.010、0.015、0.020 g·mL-1，進行3 因素3 水平的正交試驗。根據分析可知，溫度、瓊脂質量濃度、牛肉膏質量濃度對榆黃蘑菌絲的影響順序為溫度＞瓊脂質量濃度＞牛肉膏質量濃度。其中，榆黃蘑菌絲培養條件最佳組合為溫度32 ℃以及0.01 g·mL-1的瓊脂和0.015 g·mL-1的牛肉膏。

表9 菌絲生長條件正交試驗分析Table 9 Analysis of orthogonal test on hyphae growth conditions

3 討論與結論

筆者以榆黃蘑作為試驗材料，對其菌絲生長條件中光照時間、溫度、瓊脂質量濃度、pH、碳源、氮源進行優化篩選，為榆黃蘑的生產與推廣提供技術支持。結果表明，光照時間、pH、碳源對榆黃蘑菌絲生長的影響均不存在顯著差異，但光照時間影響菌絲轉色，光照時間越長，轉色時間越久，黑暗環境下可以加快菌絲轉色。根據馬瑋超等[25]、雷萍等[26]研究推測，榆黃蘑菌絲轉色與濾紙纖維素酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和半纖維素酶、漆酶、多酚氧化酶活性有關，光照條件下榆黃蘑菌絲相關酶活性受到抑制，從而抑制了菌絲的轉色。pH 值試驗表明，pH 值越高瓊脂凝固越快，而pH 6.50 菌絲生長濃密程度及瓊脂凝固程度都相對較適宜。原因是瓊脂的組成成分在酸性介質中會水解生成還原糖或低聚糖，從而弱化了瓊脂的凝固作用[27]。碳源為0.03 g·mL-1淀粉時，菌絲生長情況及濃密程度相對較適宜。碳源是微生物菌絲生長發育活動的主要能量來源，碳源豐富有利于菌絲的生長，但過量的碳源起不到促進生長的作用。

不同溫度對榆黃蘑菌絲生長的影響存在極顯著差異。榆黃蘑菌絲在崇左市夏季和秋季的室溫及28、32、35 ℃的恒溫環境下均可生長，溫度過低抑制菌絲生長，溫度過高會出現溶菌的現象，單因素試驗結果表明，室溫（日均溫度25 ℃）為榆黃蘑菌絲生長的最適宜溫度條件。溫度過高使某些蛋白酶類發生變質，從而出現溶菌現象。因此，控制溫度可以改善菌絲的生長情況。不同瓊脂質量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響存在極顯著差異。在封閉試管內瓊脂質量濃度越低，濕度越大，菌絲生長越快，瓊脂質量濃度越高，濕度越小，菌絲生長越慢。由于水是物質反應必不可少的成分，因此環境中缺水不利于菌絲的生長。

不同氮源對榆黃蘑菌絲生長的影響呈極顯著差異，其中牛肉膏為榆黃蘑菌絲生長最佳氮源。不同牛肉膏質量濃度對榆黃蘑菌絲生長量的影響存在顯著差異。正交試驗結果表明，0.015 g·mL-1牛肉膏為最佳含量。過量的氮源會抑制榆黃蘑菌絲的生長，但缺少氮源也不利于菌絲的生長，因此，合適的氮源是種植榆黃蘑的一個關鍵因素。溫度、濕度及氮源對榆黃蘑菌絲生長有較大的影響，因此，選擇合適的溫度、濕度及氮源對提高榆黃蘑菌絲長勢有重要意義。正交試驗結果表明，溫度、瓊脂質量濃度、牛肉膏質量濃度對榆黃蘑菌絲生長的影響順序為溫度＞瓊脂質量濃度＞牛肉膏質量濃度。因而在榆黃蘑菌絲培養過程中，要認真把握好培養的溫度、氮源的選擇、氮源的含量、瓊脂質量濃度等條件，從而更有利于菌絲穩健生長。