miRNA在哮喘患兒呼出氣冷凝物中的表達水平及診斷價值*

樊青曼,劉士霞,高 娟,穆艷順,張冬婕,劉衛華

1.華北石油管理局總醫院兒科,河北任丘 062552;2.遷西縣人民醫院兒科,河北唐山 064300;3.肅寧縣人民醫院兒科,河北滄州 062350

目前用于臨床目的的大多數哮喘生物標志物均從血液、呼氣或尿液中取樣,而誘導痰僅在專業中心可以使用[1]。呼出氣冷凝物(EBC)收集簡單,安全,無創且高度可重復,并且可以評估氣道炎癥的生物標志物,越來越多地被用作生物標志物的檢測指標[2]。EBC中的物質可以被測量,并且一些研究已經集中在非揮發性有機化合物,包括近年研究的微小RNA(miRNA)上[3]。因此,尋找EBC中新型生物標志物有助于哮喘兒童的診斷和個性化治療。有研究發現,11種miRNA(let7a-5p、miR-21-5p、miR-126-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p、miR-221-3p、miR-328-3p、miR-1248和miR-423-3p)與哮喘發生具有高度相關性[4-10]?；诖?本研究旨在探討EBC中這11個miRNA在哮喘患兒中的相對表達水平,并評估其作為診斷哮喘患兒生物標志物的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年3月至2022年12月華北石油管理局總醫院(下稱本院)收治的7～12歲哮喘患兒80例作為哮喘組,其中男51例,女29例,平均年齡(8.58±2.34)歲,平均體質量指數(BMI)為(24.66±3.44)kg/m2。并選取同期同年齡段健康志愿者80例作為對照組,其中男49例,女31例,平均年齡(8.39±3.05)歲,平均BMI為(24.49±3.28)kg/m2。兩組受試者性別、年齡和BMI比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。使用呼氣式空氣冷凝系統(便攜式TurboDECCS)從兩組受試者中收集EBC樣本。納入標準:(1)哮喘使用基于實驗陽性支氣管擴張的金標準定義,定義為吸入400 μg沙丁胺醇后第1秒用力呼氣容積(FEV1)至少增加12%或超過200 mL;(2)自我報告有哮喘癥狀的醫學診斷(喘息、呼吸困難或干咳)。排除標準:(1)有智力或認知障礙者;(2)合并有甲狀腺疾病及其他內分泌疾病者;(3)合并其他心、肝、腎等嚴重慢性疾病者;(4)合并惡性腫瘤者;(5)對調查不配合或拒絕者。本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2呼氣凝結水采集及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測EBC中相關miRNA 根據ROSIAS公布的EBC收集方法[11],從兩組受試者中收集EBC樣本,使用呼氣式空氣冷凝系統。收集前將設備冷卻到0 ℃。正常呼吸至少15 min,戴鼻夾獲取EBC樣本。通常樣本量在800～1 500 μL之間。體積的變化與兒童肺部的潮氣量和分鐘體積相關。收集后,將樣品儲存-35 ℃的加蓋玻璃管中,直至進行分析。程序在層流柜下進行,以確保環境受控,避免環境空氣污染。根據之前的相關文獻報道[4-10]選擇let7a-5p、miR-21-5p、miR-126-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p、miR-221-3p、miR-328-3p、miR-1248和miR-423-3p的11種特異性miRNA用于分析,其中let7a-5p為內參對照。用硫氰酸胍酚氯仿萃取法從0.5 mL EBC樣品中提取總的RNA。在RNA提取之前,EBC樣品摻入來自Exiqon(Qiagen)的合成UniSp6 RNA用于提取控制目的。根據制造商的說明書操作,使用小RNA試劑盒(Agilent),用Bioanalyzer(Agilent Technologies)對提取的RNA進行質量控制。采用鎖定核酸(LNA)試劑進行逆轉錄和qPCR 技術檢測。采用Universal cDNA synthesis kit Ⅱ(Exiqon)將從每個EBC樣品中提取的RNA一式兩份逆轉錄。每個RT反應使用10 μL RNA溶液。將得到的cDNA稀釋10倍,并使用miRNA特異性LNA寡核苷酸和ExiLENT SYBR Green master mix(Exiqon)在10 μL反應中通過qPCR進行定量。使用StepOnePlus實時PCR系統(Applied Biosystems)在兩步程序下進行qPCR檢測:95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,45個循環。使用2-ΔΔCt法評估樣本中miRNA的相對表達水平。

1.3統計學處理 采用R 3.4軟件進行統計學分析。采用t檢驗分析兩組EBC中相關miRNA的表達水平。應用主成分分析法(PCA)和因子分析對miRNAs進行聚類分析。應用受試者工作特征(ROC)曲線及曲線下面積(AUC)分析EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p對哮喘患兒的臨床診斷價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1對照組和哮喘組EBC中相關miRNA的相對表達水平 哮喘組EBC中miR-21-5p、miR-133-3p的相對表達水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。哮喘組EBC中miR-328-3p、miR-155-5p的相對表達水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 對照組和哮喘組EBC中相關miRNA的表達水平

2.2PCA和因子分析對照組和哮喘組受試人員EBC中相關miRNA 將差異有統計學意義的miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p進行PCA,發現根據對照組和哮喘組EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的相對表達水平可以形成兩個獨立亞群,即體檢健康者和哮喘患兒,見圖1。因子分析結果發現miR-21-5p、miR-155-5p可以聚成一個亞類(因子載荷分別為0.93和0.90),miR-133-3p、miR-328-3p聚成一個亞類(因子載荷分別為0.86和0.80),見圖2。

圖1 PCA和因子分析對照組和哮喘組受試人員EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p

圖2 因子分析對照組和哮喘組受試人員EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p

2.3EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p對哮喘的診斷效能 為了評估EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p在哮喘患兒與健康兒童中的診斷價值,繪制80例哮喘患兒和80例健康兒童的ROC曲線(圖3)。以miR-133-3p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為93.77%,特異度為94.01%。以miR-328-3p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為92.41%,特異度為91.07%。以miR-21-5p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為95.23%,特異度為91.48%。以miR-155-5p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為92.57%,特異度為91.35%,見圖3和表2。

圖3 健康兒童與哮喘患兒EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的ROC曲線

表2 EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p鑒別診斷健康兒童與哮喘患兒的AUC、靈敏度、特異度和約登指數

2.4miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯合對哮喘患兒的診斷價值 患有哮喘為真陽性,未患有哮喘的為真陰性。miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯合對哮喘患兒的診斷靈敏度為97.50%(78/80),特異度為92.50%(74/80),準確度為95.00%(152/160),見表3。

表3 miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯合診斷對哮喘患兒的診斷價值(n)

3 討 論

哮喘是兒童常見的慢性疾病之一,給患兒及家庭帶來了健康威脅和經濟負擔[1]。在臨床實踐中,基于肺活量測定法對診斷兒童哮喘的敏感性很低,對診斷兒童哮喘的準確客觀測試的需求仍未得到滿足[12]。本研究結果顯示哮喘患兒與健康兒童EBC中的miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的靈敏度分別為93.77%、92.41%、95.23%、92.57%,特異度分別為94.01%、91.07%、91.48%、91.35%。miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯合對哮喘患兒的診斷靈敏度為97.50%,特異度為92.50%,準確度為95.00%,顯示了較好的診斷效能。

呼氣凝結物是一種無創收集的生物流體,含有揮發性和非揮發性化合物,在肺部疾病中可能會發生改變[13]。PINKERTON等[14]報道,EBC中的miR-21-5p、miR-133-3p、miR-155-5p和miR-328-3p在哮喘成人患者中明顯降低。本研究發現,哮喘組EBC中miR-21-5p和miR-133-3p的相對表達水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),與PINKERTON等[14]報道一致。但是miR-328-3p和miR-155-5p的相對表達水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。這些研究結果的差異可能與年齡組及樣本量有關。根據對照組和哮喘組EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的相對表達水平可以形成兩個獨立亞群,即體檢健康者和哮喘患兒。因子分析結果發現miR-21-5p、miR-155-5p可以聚成一個亞類(因子載荷分別為0.93和0.90),miR-133-3p、miR-328-3p聚成一個亞類(因子載荷分別為0.86和0.80)。因子分析中的因子負荷可以解釋為miRNAs對聚類有顯著貢獻的相關系數。因此,miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p可以很好地區分哮喘患兒和健康兒童。

一些關于miRNA表達譜的研究報告了miRNA在哮喘調節中的重要性[15]。miR-155-5p在哮喘兒童的血漿中明顯增加,是血漿中的生物標志物[16]。Th1/Th2平衡對哮喘的發生發展具有重要作用[17]。miR-21-5p可以促進Th2并減弱Th1途徑,而輕度哮喘患者中miR-155-5p的上調似乎可以抑制白細胞介素(IL)-13誘導的細胞因子表達[18-19]。在miR-21和無癥狀的積極支氣管擴張之間發現的關聯可以解釋為這種miR-21在負向調節IL-12方面的作用,這對調節Th1/Th2平衡很重要,因為這種IL的表達減少會誘發過度的Th2反應[20]。miR-133-3p可以調節IL-13,這表明這一途徑的失調可能對Th2細胞因子的表達和信號有重大影響[21]。

綜上所述,EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p可作為診斷哮喘的潛在標志物。