逍遙散通過調節腫瘤免疫微環境抑制肺轉移前微環境形成

湯曉霞　鄧皖利　張勇　陳彬　柴妮　張澍　謝曼麗

摘要：目的 探討逍遙散抗腫瘤轉移作用的機制。方法 建立小鼠結腸癌CT26.WT移植瘤及肺轉移模型，通過活體成像、肺組織解剖以及HE染色評價不同劑量（200、400、800 mg）逍遙散干預下的肺轉移情況。免疫熒光及Western blot檢測腫瘤M2型巨噬細胞標志物CD206、ARG1、PDL2表達；酶聯免疫吸附試驗檢測血清中轉化生長因子（TGF）-β和腫瘤壞死因子（TNF）-α的水平；流式細胞術檢測肺組織中血管內皮生長因子受體1陽性（VEGFR1+）髓系細胞的募集情況；Western blot檢測原位腫瘤組織磷脂酰肌醇3激酶（STAT3）、血管內皮生長因子（VEGF）及肺組織中轉移前微環境標志物基質金屬蛋白酶（MMP）-9、S100A8及Fibronectin表達。結果 逍遙散干預后，肺轉移灶顯著減少，小鼠肺組織中MMP-9、S100A8及Fibronectin的表達量顯著降低，腫瘤相關巨噬細胞發生M1極化，血清中TGF-β的水平顯著降低，TNF-α的水平顯著升高，小鼠肺組織中VEGFR1+髓系細胞募集明顯減少，腫瘤組織中STAT3磷酸化被抑制，VEGF表達量顯著降低。結論 逍遙散的抗腫瘤轉移活性與其抑制轉移前微環境的能力有關，并且這種抑制作用可能通過腫瘤相關巨噬細胞的表型轉化以及抑制STAT3信號轉導實現。

關鍵詞：逍遙散；腫瘤免疫微環境；轉移前微環境；腫瘤相關巨噬細胞；腫瘤轉移

中圖分類號：R73-37文獻標志碼：ADOI：10.11958/20220136

XiaoYaoSan inhibits lung pre-metastatic niche formation through tumor immune microenvironment regulation

TANG Xiaoxia DENG Wanli ZHANG Yong CHEN Bin CHAI Ni ZHANG Shu XIE Manli

1 Putuo Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200062， China; 2 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine;

3 Changzheng Town Community Health Service Center， Putuo District

△Corresponding Author E-mail： 6274718522@qq.com

Abstract： Objective To investigate the mechanism of XiaoYaoSan in anti-tumor metastasis. Methods A mouse model of CT26.WT colon cancer xenograft and lung metastasis was established. In vivo imaging of small animals， lung tissue anatomy and HE staining were performed to evaluate the lung metastasis under different doses （200， 400 and 800 mg） of XiaoYaoSan intervention. Tumor M2 macrophage markers were detected by immunofluorescence and Western blot assay. Serum levels of transforming growth factor （TGF） -β and tumor necrosis factor （TNF） -α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The recruitment of VEGFR1+ myeloid cells in lung tissue was detected by flow cytometry. The expression levels of phosphatidylinositol 3-kinase （STAT3）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and pre-metastasis microenvironment markers matrix metalloproteinase （MMP） -9， S100A8 and Fibronectin were detected by Western blot assay. Results After XiaoYaoSan intervention， the lung metastasis was significantly reduced， expression levels of MMP-9， S100A8 and Fibronectin in lung tissue were significantly decreased， M1 polarization occurred in tumor-associated macrophages， the serum level of TGF-β was significantly decreased， and TNF-α level was significantly increased. The recruitment of VEGFR1+ myeloid cells was significantly decreased in lung tissue， STAT3 phosphorylation was inhibited， and VEGF expression was significantly decreased. Conclusion The antimetastatic activity of XiaoYaoSan is related to its ability to inhibit the pre-metastatic microenvironment， which may be realized by the phenotypic transformation of tumor-associated macrophages and inhibition of STAT3 signal transduction.

Key words： Xiao Yao San; tumor immune microenvironment; PMNs; TAMs; tumor metastasis

惡性腫瘤作為僅次于心血管疾病的第二大死因，其預防與治療一直是醫學界的研究熱點［1］。約90%的惡性腫瘤死亡患者，其死因與腫瘤轉移相關［2］。因此，研究與開發抗腫瘤轉移藥物具有重要的現實意義。研究表明，腫瘤的遠端轉移依賴于靶器官轉移前微環境的形成［3-4］，而原發病灶中的腫瘤相關巨噬細胞又在遠端器官感知腫瘤細胞并形成轉移前微環境的過程中發揮重要作用［5-7］。因此，腫瘤相關巨噬細胞可能是抗腫瘤轉移藥物的一個潛在治療靶點。傳統中醫藥在腫瘤的防治中具有獨特優勢。逍遙散作為經典的疏肝解郁方劑，具有疏肝健脾，養血解郁之功效。研究表明，其可通過影響腫瘤細胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路［8］，降低體內雌激素水平、抑制腫瘤細胞增殖和侵襲［9］來抑制乳腺癌的進展。逍遙散對于腫瘤轉移的抑制作用已得到證實，但其機制尚不清楚。本研究主要探討其通過調節腫瘤免疫微環境抑制肺轉移前微環境形成的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 逍遙散組方由甘草12 g、當歸12 g、茯苓30 g、白芍 12 g、柴胡12 g組成，由上海中醫藥大學附屬普陀醫院中藥房提供。將藥材粉碎、水煎并過濾后濃縮成含生藥1.6 g/mL的水煎劑。熒光素酶標記的小鼠結腸癌CT26.WT/LUC細胞購自寧波明舟生物科技有限公司。SPF級5周齡雌性BALB/C小鼠40只，體質量（22±3）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心SPF級屏障環境中。動物使用許可證號：SYXK（滬）2018-0040。HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。鼠源基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、S100鈣結合蛋白A8（S100A8）、纖維連接蛋白（Fibronectin）、血管內皮生長因子（VEGF）、M2巨噬細胞標志物CD206、血管內皮生長因子受體1（VEGFR1）、髓系細胞標志物CD11b抗體購自英國Abcam公司。磷酸化信號轉導與轉錄激活因子3（p-STAT3）、信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）、精氨酸酶1（ARG1）、細胞程序性死亡蛋白1配體2（PDL2）抗體購自CST公司，F4/80、β-actin抗體購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶（HRP）偶聯二抗購自SouthernBiotech公司，APC和FITC熒光標記二抗購自Thermo Fisher公司。轉化生長因子（TGF）-β和腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自ABclonal公司。石蠟切片機、倒置熒光顯微鏡購自Leica公司，化學發光成像系統購自Bio-Rad公司，全波長酶標儀購自Thermo Fisher公司，流式細胞儀購自BD公司。

1.2 動物建模及給藥 取熒光素酶標記的小鼠結腸癌CT26.WT/LUC細胞懸液，計數后按每只小鼠2×105個細胞接種至小鼠左前肢腋下，建立小鼠結腸癌模型。然后采用隨機數字表法將其分為4組：模型組，低、中、高劑量逍遙散組，每組10只。接種次日開始，模型組每日生理鹽水0.5 mL灌胃，低、中、高劑量組每日分別給予200、400、800 mg逍遙散水煎劑濃縮液灌胃（按生藥計）。連續灌胃28 d，每3 d進行1次活體成像。在第14天每組取5只小鼠，脫頸處死后摘除眼球取血、分離原位腫瘤及肺組織，第28天取剩余小鼠，分離肺組織用于HE染色。

1.3 肺組織HE染色 將肺組織切成小塊，常規固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、蘇木精及伊紅染色后脫水進行封片，顯微鏡下觀察病理改變。

1.4 Western blot檢測蛋白表達 將原位腫瘤組織、肺組織進行勻漿處理后，提取總蛋白并煮沸變性，使用BCA法進行蛋白定量，按每孔40 μg蛋白進行上樣。使用5%濃縮膠及10%分離膠按恒壓100 V進行SDS-PAGE，恒流400 mA濕轉1 h將目的蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶進行封閉1 h，TBST洗膜后加入對應一抗MMP-9、S100A8、Fibronectin、VEGF、CD206、p-STAT3、STAT3、ARG1（均為1∶800稀釋）、PDL2、β-actin（1∶5 000稀釋），4 ℃振搖過夜，次日回收一抗，TBST洗膜后加入二抗（1∶10 000）孵育1 h，TBST洗膜后使用化學發光試劑盒，于凝膠成像系統上進行曝光，使用Image J軟件進行灰度分析。

1.5 ELISA檢測血清TGF-β、TNF-α表達 按試劑盒說明書進行操作，檢測血清TGF-β、TNF-α表達水平，在全波長酶標儀上讀取吸光度，并根據標準曲線轉換為相應濃度。

1.6 免疫熒光染色法檢測M1型巨噬細胞標志物iNOS表達 將腫瘤組織切成小塊，常規固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后置于檸檬酸鹽修復液中進行高溫抗原修復，PBS清洗后加入0.2% TritonX-100進行透化，PBS清洗，加入山羊血清封閉1 h，PBS清洗后加入F4/80和iNOS一抗（1∶5 000稀釋），4 ℃孵育過夜，次日回收一抗后PBS清洗，加入熒光二抗，暗盒中孵育1 h，PBS清洗后加入DAPI，暗盒中染色15 min，PBS清洗后封片，進行熒光顯微鏡下觀察。

1.7 流式細胞術分析VEGFR1+髓系細胞比例 肺組織進行勻漿處理后，將細胞用濾網過濾，加入流式上樣管中，加入5 μL的Fc阻斷劑，室溫避光孵育5 min；隨后加入APC-VEGFR1、FITC-CD11b抗體各5 μL，避光孵育15 min；再加入紅細胞裂解液3 mL，避光孵育6～8 min，待細胞懸液澄清后800×g離心5 min，吸去上清液，加入300 μL PBS，重復離心3次，混勻后上機檢測VEGFR1+髓系細胞比例。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Turkey法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 逍遙散減少小鼠結腸癌移植瘤的肺轉移 結腸癌移植瘤小鼠分組灌胃處理28 d后，小動物活體成像及肺組織解剖觀察到模型組結腸癌移植瘤出現明顯的肺轉移；模型組，逍遙散低、中、高劑量組肺轉移灶數量分別為（52.67±6.64）個、（38.33±7.22）個、（23.67±4.33）個、（16.33+3.28）個，與模型組相比，逍遙散中、高劑量組的轉移灶數量均下降（F=27.433，P＜0.05）。HE染色顯示，模型組肺組織實質化，腫瘤細胞大量浸潤，逍遙散各劑量組的肺泡空腔明顯。見圖1、2。

2.2 各組MMP-9、S100A8及Fibronectin表達水平比較 各組小鼠分組灌胃處理14 d后，與模型組相比，逍遙散中、高劑量組小鼠肺組織中S100A8蛋白表達下降（P＜0.01），逍遙散低、中、高劑量組MMP-9和Fibronectin蛋白表達下降（P＜0.01），見圖3、表1。

2.3 逍遙散促進腫瘤相關巨噬細胞向M1表型極化 免疫熒光染色結果顯示，與模型組相比，逍遙散中、高劑量組原位腫瘤組織中M1型巨噬細胞（F4/80+/iNOS+細胞）的數量增加；Western blot結果顯示，與模型組相比，逍遙散各劑量組M2型巨噬細胞標志物CD206、PDL2表達量均下降，中、高劑量組ARG1表達下降；ELISA結果顯示，與模型組相比，逍遙散中、高劑量組血清中TNF-α的含量升高，而TGF-β的含量降低，見圖4、5，表2。

2.4 各組肺組織VEGFR1+髓系細胞水平比較 模型組，逍遙散低、中、高劑量組VEGFR1+髓系細胞比例分別為（1.32±0.16）%、（0.84±0.10）%、（0.71±0.11）%、（0.71±0.05）%。與模型組相比，逍遙散各劑量組小鼠肺組織中VEGFR1+髓系細胞比例明顯下降（F=34.850，P＜0.01），見圖6。

2.5 各組肺組織p-STAT3及VEGF蛋白表水平比較 與模型組相比，逍遙散各劑量組的肺組織中p-STAT3及VEGF蛋白表達水平下降（P＜0.05），見圖7、表3。

3 討論

在惡性腫瘤的發展進程中，遠端器官轉移是不可避免的，然而正常器官組織的環境并不適合腫瘤細胞生長。近年來的研究發現，在腫瘤細胞到達遠端靶器官之前，原發腫瘤就已釋放出某種“信號”，使得遠端靶器官的微環境發生改變，從而變得更適合腫瘤細胞定植［10-11］，為腫瘤細胞順利轉移提供一張“溫床”，具體表現為MMP-9、S100A8、Fibronectin的表達量增加以及VEGFR+的髓系細胞募集［12-14］，而此時轉移灶還未形成，因此被稱為轉移前微環境。既往研究發現，逍遙散具有一定的抗腫瘤效果。秦生發等［15］發現逍遙散能夠下調肝郁脾虛癥模型大鼠MMP-2的表達，減少罹患胃癌的風險。楊璦竹［16］研究發現，逍遙散通過抑制炎性因子，調控PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和轉移。據此，本研究探討了逍遙散的這種抗腫瘤轉移作用是否與轉移前微環境的形成有關。筆者建立小鼠結腸癌CT26.WT細胞移植瘤模型，證明逍遙散干預后能夠有效抑制肺轉移前微環境的形成。

原發腫瘤組織中，除了腫瘤細胞外，還存在大量間質細胞，其共同構成了腫瘤免疫微環境［17］。腫瘤組織中的巨噬細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞。其M2表型產生的TGF-β能夠促進肺組織中Fibronectin的形成［18］。本研究發現，逍遙散干預后可促進原位腫瘤相關巨噬細胞發生M1極化，減少TGF-β的釋放，進而減少Fibronectin的生成。STAT3信號通路調控了其下游多種效應物的轉錄與激活，其中包括VEGF［19-20］。腫瘤相關巨噬細胞中的STAT3通路處于激活狀態，VEGF大量釋放，導致腫瘤血管新生［21］，還能夠促進含有VEGF受體的髓系細胞在外周募集［22］。本研究發現，逍遙散干預后，腫瘤組織中的STAT3磷酸化得到不同程度的抑制，其下游效應物VEGF的表達也出現相應的減少，通過對肺組織中的VEGFR1+髓系細胞進行分析，也證實逍遙散干預后，其在肺組織中募集顯著減少。綜合這些結果，筆者推測逍遙散的抗腫瘤轉移活性與其抑制轉移前微環境的能力有關，并且這種抑制作用可能是通過腫瘤相關巨噬細胞的表型轉化以及抑制STAT3信號轉導實現的。本研究初步探討了逍遙散抗腫瘤轉移活性的部分機制，為其抗腫瘤作用的后續研究以及臨床應用提供了新的理論參考。

參考文獻

［1］ FERLAY J，COLOMBET M，SOERJOMATARAM I，et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018： GLOBOCAN sources and methods［J］. Int J Cancer，2019，144（8）：1941-1953. doi：10.1002/ijc.31937.

［2］ SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A. Cancer statistics， 2020［J］. CA Cancer J Clin，2020，70（1）：7-30. doi：10.3322/caac.21590.

［3］ PEINADO H，ZHANG H，MATEI I R，et al. Pre-metastatic niches： organ-specific homes for metastases［J］. Nat Rev Cancer，2017，17（5）：302-317. doi：10.1038/nrc.2017.6.

［4］ SCENEAY J，SMYTH M J，M?LLER A. The pre-metastatic niche： finding common ground［J］. Cancer Metastasis Rev，2013，32（3/4）：449-464. doi：10.1007/s10555-013-9420-1.

［5］ JOYCE J A，POLLARD J W. Microenvironmental regulation of metastasis［J］. Nat Rev Cancer，2009，9（4）：239-252. doi：10.1038/nrc2618.

［6］ CHEN P，BONALDO P. Role of macrophage polarization in tumor angiogenesis and vessel normalization： implications for new anticancer therapies［J］. Int Rev Cell Mol Biol，2013，301：1-35. doi：10.1016/B978-0-12-407704-1.00001-4.

［7］ KITAMURA T，QIAN B Z，POLLARD J W. Immune cell promotion of metastasis［J］. Nat Rev Immunol，2015，15（2）：73-86. doi：10.1038/nri3789.

［8］ 何燦封，孫玲玲，林麗珠. 基于網絡藥理學探究逍遙散治療乳腺癌的潛在機制［J］. 中國醫院藥學雜志，2020，40（21）：2220-2226. HE C F，SUN L L，LIN L Z. Potential mechanism of Xiaoyao San for breast cancer based on network pharmacology［J］. Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2020，40（21）：2220-2226. doi：10.13286/j.1001-5213.2020.21.03.

［9］ 楊佳慧. 丹梔逍遙散調控腫瘤相關成纖維細胞抑制乳腺癌生長、轉移及分子機制［D］. 沈陽：遼寧中醫藥大學，2020. YANG J H. Danzhi Xiaoyao powder inhibits the growth， metastasis and molecular mechanism of breast cancer by regulating tumor-associated fibroblasts［D］. Shenyang：Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，2020.

［10］ GIL-BERNAB? A M，FERJANCIC S，TLALKA M，et al. Recruitment of monocytes/macrophages by tissue factor-mediated coagulation is essential for metastatic cell survival and premetastatic niche establishment in mice［J］. Blood，2012，119（13）：3164-3175. doi：10.1182/blood-2011-08-376426.

［11］ SHARMA S K，CHINTALA N K，VADREVU S K，et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs［J］. J Immunol，2015，194（11）：5529-5538. doi：10.4049/jimmunol.1403215.

［12］ PSAILA B，LYDEN D. The metastatic niche： adapting the foreign soil［J］. Nat Rev Cancer，2009，9（4）：285-293. doi：10.1038/nrc2621.

［13］ DENG J，LIU Y，LEE H，et al. S1PR1-STAT3 signaling is crucial for myeloid cell colonization at future metastatic sites［J］. Cancer Cell，2012，21（5）：642-654. doi：10.1016/j.ccr.2012.03.039.

［14］ SAFARZADEH E，ORANGI M，MOHAMMADI H，et al. Myeloid-derived suppressor cells： Important contributors to tumor progression and metastasis［J］. J Cell Physiol，2018，233（4）：3024-3036. doi：10.1002/jcp.26075.

［15］ 秦生發，張錚，藍敏敏，等. 逍遙散對慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠MMP2、TIMP2表達的影響［J］. 中國中醫基礎醫學雜志，2021，27（7）：1084-1088. QIN S F，ZHANG Z，LAN M M，et al. Effects of Xiaoyao Powder on expression of MMP2 and TIMP2 in rats with chronic restraint stress of liver depression and spleen deficiency syndrome［J］. Chinese Journal of Basic Medicine in Traditional Chinese Medicine，2021，27（7）：1084-1088.

［16］ 楊璦竹. 基于PI3K/AKT通路探討丹梔逍遙散抗乳腺癌骨轉移的影響與機制研究［D］. 沈陽：遼寧中醫藥大學，2021：15-17. YANG A Z. The effect and mechanism of Danzhi Xiaoyao powder on bone metastasis of breast cancer based on PI3K/AKT pathway［D］. Shenyang：Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，2021：15-17.

［17］ MCALLISTER S S，WEINBERG R A. The tumour-induced systemic environment as a critical regulator of cancer progression and metastasis［J］. Nat Cell Biol，2014，16（8）：717-727. doi：10.1038/ncb3015.

［18］ BANSOD S，DOIJAD N，GODUGU C. Berberine attenuates severity of chronic pancreatitis and fibrosis via AMPK-mediated inhibition of TGF-β1/Smad signaling and M2 polarization［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2020，403：115162. doi：10.1016/j.taap.2020.115162.

［19］ TO?I? I，FRANK D A. STAT3 as a mediator of oncogenic cellular metabolism： Pathogenic and therapeutic implications［J］. Neoplasia，2021，23（12）：1167-1178. doi：10.1016/j.neo.2021.10.003.

［20］ GHARIBI T，BABALOO Z，HOSSEINI A，et al. Targeting STAT3 in cancer and autoimmune diseases［J］. Eur J Pharmacol，2020，878：173107. doi：10.1016/j.ejphar.2020.173107.

［21］ MA Z，WEI K，YANG F，et al. Tumor-derived exosomal miR-3157-3p promotes angiogenesis， vascular permeability and metastasis by targeting TIMP/KLF2 in non-small cell lung cancer［J］. Cell Death Dis，2021，12（9）：840. doi：10.1038/s41419-021-04037-4.

［22］ MENG D，MENG M，LUO A，et al. Effects of VEGFR1（+） hematopoietic progenitor cells on pre-metastatic niche formation and in vivo metastasis of breast cancer cells［J］. J Cancer Res Clin Oncol，2019，145（2）：411-427. doi：10.1007/s00432-018-2802-6.

（2022-01-23收稿 2022-09-18修回）

（本文編輯 胡小寧）