紫杉醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠細胞焦亡的影響及其機制的研究

潘婷　李作孝　晚麗

摘要：目的 探討紫杉醇（PTX）通過抑制NLRP3/caspase-1通路減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠細胞焦亡的影響機制。方法 將50只雌性C57BL/6小鼠按照隨機數字表法分為正常對照組、EAE模型組及PTX低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組外，其余組建立EAE模型。PTX低、中、高劑量組每日分別腹腔注射PTX 1、2、4 mg/（kg·d），正常對照組和EAE模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續14 d。從免疫當日開始，每日定時觀察并記錄小鼠體質量變化、精神、活動情況及進行神經功能障礙評分；對各組脊髓組織進行尼氏染色和LFB染色觀察病理改變；熒光定量PCR（qPCR）檢測脊髓組織NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）及胱天蛋白酶（caspase）-1 mRNA表達水平。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測外周血白細胞介素（IL）-18和IL-1β含量。結果 正常對照組小鼠無明顯癥狀，EAE模型組和PTX低、中、高劑量組體質量下降、活動減少、反應遲鈍。與EAE模型組相比，PTX各劑量組發病潛伏期延長，高峰期延遲，神經功能障礙評分降低（P＜0.05），脊髓組織尼氏小體數量增多且相對規則，脫髓鞘、空泡改變減輕，外周血IL-18、IL-1β含量降低，NLRP3、caspase-1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；PTX劑量越高，發病潛伏期和高峰期延遲越明顯；脊髓組織尼氏小體數量增多，排列及形態更規則，脫髓鞘及空泡改變越輕，外周血IL-1β、IL-18含量越低，caspase-1 mRNA表達水平越低（P＜0.05）。結論 PTX可能通過抑制細胞焦亡，減輕EAE小鼠炎癥反應，其機制可能與抑制NLRP3/caspase-1通路有關。

關鍵詞：多發性硬化；腦脊髓炎，自身免疫性，實驗性；細胞焦亡；紫杉醇；NLRP3/caspase-1通路

中圖分類號：R744.51文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221146

Study on the effect and mechanism of paclitaxel on pyroptosis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis

PAN Ting， LI Zuoxiao WAN Li

Department of Neurology， the Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Luzhou 646000， China

△Corresponding Author E-mail： lzx3235@sina.com

Abstract： Objective To investigate the effect of taxol （PTX） on pyroptosis of experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE） mice by inhibiting NOD-like receptor thermoprotein domain-associated protein 3 （NLRP3）/caspase-1 pathway. Methods Fifty female C57BL/6 mice were randomly divided into the normal control group， the EAE model group， the PTX low-dose， medium-dose and high-dose groups according to the random number table method， with 10 mice in each group. EAE model was established in other groups except the normal control group. PTX low-dose， medium-dose and high-dose groups were intraperitoneally injected with 1， 2 and 4 mg/kg PTX everyday， respectively， and normal control group and EAE model group were intraperitoneally injected with the same amount of normal saline for 14 consecutive days. From the day of immunization， changes of body weight， mental state， activity state and neurological dysfunction score of mice were observed and recorded regularly every day. Nissl staining and LFB staining were used to observe pathological changes. The mRNA expression levels of NLRP3 and caspase-1 in crushed tissues were detected by quantitative fluorescence PCR （qPCR）. Levels of interleukin （IL） -18 and IL-1β in peripheral blood were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results There were no obvious symptoms in mice of the normal control group. Mice in the EAE model group and the PTX low-， medium-， and high-dose groups showed decreased body weight， decreased activity and sluggish response. Compared with the EAE model group， the latency and peak period were delayed in the PTX dose groups， the neurological dysfunction score at peak period was decreased （P＜0.05）. The number of Nyssome in spinal cord tissue was increased and relatively regular， demyelination and vacuolar changes were alleviated， and the mRNA expression levels of NLRP3 and caspase-1 were decreased. The higher the PTX dose， the more obvious the latency and peak delay. The number of Nyssome in spinal cord increased， the arrangement and morphology were more regular， the demyelination and vacuolation changes were lighter， the mRNA expression level of caspase-1 and the contents of IL-1β and IL-18 in peripheral blood were lower （P＜0.05）. Conclusion PTX may reduce the damage of pyroptosis in EAE mice by inhibiting NLRP3/caspase-1 pathway related inflammatory factors.

Key words： multiple sclerosis; encephalomyelitis， autoimmune， experimental; pyroptosis; paclitaxel; NLRP3/caspase-1 pathway

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種自身免疫性疾病，主要以神經系統脫髓鞘和神經退行性變為特征［1］。目前MS發病趨年輕化且易復發，治療手段有限［2-4］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelims，EAE）可破壞血腦屏障并使其通透性增高，病理改變與MS相似，可作為研究MS常用的動物模型［5］。細胞焦亡是細胞在胱天蛋白酶（caspase）家族調控下介導的炎癥反應［6］。當細胞受到刺激時，細胞內的受體識別相應的配體，促使NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）及caspase-1組成NLRP3炎性小體，炎性小體剪切活化caspase-1前體，caspase-1活化后，使gasdermin D（GSDMD）結合細胞膜形成裂孔，同時活化白細胞介素（IL）-18、IL-1β，促進細胞焦亡［7］。研究表明，MS炎癥反應與NLRP3炎性小體信號通路及細胞焦亡關系密切［8］。紫杉醇（paclitaxel，PTX）廣泛用于腫瘤疾病治療［9］，也可調節炎癥反應［10］，但其對EAE小鼠細胞焦亡炎癥影響的研究較少。本研究旨在觀察PTX對EAE模型小鼠的影響，探討其作用機制是否與NLRP3/caspase-1信號通路介導的細胞焦亡途徑有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6健康雌性小鼠50只，6～8周齡，體質量20～25 g，購于武漢恒意賽生物科技有限公司。動物生產許可證號：SCXK（鄂）2020-0018，由西南醫科大學忠山動物實驗室統一飼養。環境通風清潔、室溫26 ℃左右，維持濕度50%左右，12 h明/暗循環，進食及飲水自由。實驗操作符合西南醫科大學實驗動物福利倫理（20210601-4）。

1.2 主要試劑及儀器 PTX購自武漢阿拉丁生物有限公司，MOG35-55多肽購自國泰生物，滅活結核分枝桿菌購自BD公司，完全弗氏佐劑（CFA）購自Sigma，RNA提取試劑盒、逆轉錄及PCR試劑盒、IL-18和IL-1β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自ELK Biotechnology；普通光學顯微鏡（OLYMPUS公司，型號CX21）、臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、熒光定量PCR儀（Life technologies，型號StepOneTM Real-Time PCR System）、冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及EAE小鼠模型建立 按照隨機數字表法將50只小鼠分為正常對照組、EAE模型組及PTX低、中、高劑量組，每組10只。MOG35-55多肽用生理鹽水稀釋成5 g/L，再與相同體積的CFA和一定量滅活結核分支桿菌混合，形成油包水乳劑，配制成4 g/L的結核桿菌H37Ra溶液，于除正常對照組外的其他各組小鼠于脊柱兩側選取4點予以0.1 mL皮下注射完成造模，正常對照組注射等量生理鹽水。

1.3.2 藥物干預 實驗藥物劑量參照體表面積等效劑量比換算，PTX低、中、高劑量組小鼠于免疫當日開始分別給藥PTX 1、2、4 mg/（kg·d），正常對照組和EAE模型組同時給予等量生理鹽水，均采用腹腔注射給藥，連續14 d。

1.3.3 發病情況觀察 從免疫當日開始，每日定時觀察并記錄小鼠體質量變化、精神、活動情況；各組小鼠按Kono評分標準進行神經功能障礙評分：0分，無相關臨床癥狀；1分，尾部力量下降；2分，雙側后肢無力，可自主翻身；3分，雙側后肢癱瘓，不可自主翻身；4分，四肢癱瘓；5分，瀕死或者死亡；癥狀介于兩者則±0.5分。小鼠自造模開始至出現癥狀時判定為發病潛伏期，神經功能障礙評分連續3日不增加，四肢癱瘓甚至死亡判定為發病高峰期。

1.3.4 取材及標本處理 發病小鼠于發病高峰期眼球取血后處死、取材，未發病小鼠及正常對照組小鼠于造模后28 d眼球取血后處死、取材。（1）血清標本：采用眼球取血，離心收集血清。（2）病理取材：小鼠于麻醉后開胸，充分暴露心臟，注入生理鹽水充分沖洗，予以40 g/L多聚甲醛固定，隨后斷頭處理，取出脊髓組織，放置于固定液中浸泡1 d，固定標本采用常規石蠟包埋，以脊髓腰膨大處取樣連續切片，切片厚度約4 μm，每組選取其中3張用于尼氏染色，另選3張用于LFB染色。

1.3.5 脊髓組織病理學觀察 尼氏染色：將石蠟切片脫蠟至水、組化筆圈畫組織、純水洗脫、尼氏染色液染色、純水洗脫、晾干后中性樹膠封片、尼氏小體計數。LFB染色：石蠟切片脫蠟至水、組化筆圈畫組織、純水洗脫、LFB染色液染色、乙醇分化純水洗脫、脫水封片。

1.3.6 熒光定量PCR（qPCR）檢測小鼠NLRP3、caspase-1 mRNA表達 提取各組脊髓組織總RNA，根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，由武漢金開瑞生物工程有限公司設計并合成NLRP3、caspase-1引物，見表1。根據擴增條件在PCR儀上進行基因片段擴增。PCR反應體系：2×PCR Master Mix 5.0 μL，引物工作液（2.5 μmol/L）上下游各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 2.0 μL，Rox 1.0 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，循環重復40次；測得Ct值后，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.3.7 ELISA檢測IL-18和IL-1β含量 按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-18和IL-1β的表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTX對各組小鼠行為學和神經功能的影響 正常對照組小鼠無明顯癥狀。EAE模型組和PTX低、中、高劑量組體質量下降、活動減少、反應遲鈍，以尾部力量降低為先發癥狀。與EAE模型組比較，PTX各劑量組小鼠發病潛伏期延長，高峰期延遲，神經功能障礙評分下降（P＜0.05）；PTX低、中、高劑量組發病潛伏期逐漸延長，高峰期逐漸延遲（P＜0.05），神經功能障礙評分差異無統計學意義，見表2。

2.2 PTX對脊髓組織病理學影響 尼氏染色結果顯示，正常對照組小鼠脊神經元分布及形態未見明顯異常；EAE模型組小鼠病程高峰期脊髓神經細胞中炎性細胞增多，尼氏小體數量減少、形態及排列不規則；PTX各劑量組尼氏小體數量較EAE模型組增多且相對規則，隨著PTX劑量升高，尼氏小體數量增多，排列及形態更規則，見圖1。LFB染色結果顯示，正常對照組未見明顯脫髓鞘及空泡改變，EAE模型組和PTX各劑量組存在不同程度脊髓組織脫髓鞘和空泡樣改變，且PTX劑量越高，脫髓鞘及空泡改變越少，見圖2。

2.3 各組小鼠外周血IL-1β、IL-18含量變化 與正常對照組相比，EAE模型組小鼠外周血IL-1β、IL-18含量增加（P＜0.05）；與EAE模型組相比，PTX各劑量組小鼠外周血IL-1β、IL-18含量降低，且PTX劑量越高，小鼠外周血IL-1β、IL-18含量越低（P＜0.05），見表3。

2.4 各組小鼠脊髓組織NLRP3、caspase-1 mRNA表達變化 與正常對照組相比，EAE模型組小鼠脊髓組織NLRP3、caspase-1 mRNA水平升高（P＜0.05）；與EAE模型組相比，PTX各劑量組NLRP3、caspase-1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與PTX低劑量組比較，PTX中劑量組caspase-1 mRNA水平降低，PTX高劑量組NLRP3、caspase-1 mRNA水平降低（P＜0.05）；與PTX中劑量組相比，PTX高劑量組caspase-1 mRNA水平降低（P＜0.05）。見表4。

3 討論

MS發病主要損害中樞神經系統，是青年人群非創傷性神經功能障礙的主要原因之一。現階段MS尚缺乏有效藥物防治，治療費用高昂，且不可完全逆轉疾病發展。PTX是一種從紅豆杉植物中提取的萜類次生代謝產物，PTX及其衍生物具有免疫調節、抗炎等功能，臨床應用于多種腫瘤，如卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等疾病［11］。研究表明其也可能是阿爾茨海默病［12］、風濕性關節炎［13］的潛在治療藥物。PTX的免疫調節機制可能與抑制有絲分裂有關，PTX可作用于微管系統，影響微管聚合，抑制微管降解，使細胞分裂停滯于G2/M期，誘導多種癌細胞的凋亡或焦亡。有研究表明，PTX通過影響微管蛋白及其二聚體的動態平衡來誘導腫瘤細胞的程序性死亡［14］；其作為一種微管穩定藥物，通過誘導α-微管蛋白乙酰化，增強NLRP3炎癥小體的激活，誘導細胞發生凋亡或焦亡［10，15］。已有研究提出，抗腫瘤藥物（如阿倫托珠單抗、奧瑞組單抗等）可用于MS治療，降低MS復發率，延緩殘疾進展［16-18］。本研究探究PTX是否減輕MS脊髓炎癥反應，發現PTX能夠有效減輕EAE小鼠的臨床癥狀，降低神經功能障礙評分，減輕EAE小鼠中樞神經系統炎癥、脫髓鞘及空泡改變，PTX劑量越高，發病潛伏期越長、高峰期推遲越明顯，且中樞神經系統炎癥、脫髓鞘及空泡改變越輕。

正常情況下，炎性因子發揮清除、修復、保護等功能，對機體產生積極影響［19］。MS持續自身免疫性炎癥可導致細胞焦亡啟動，炎性細胞過度激活，各種細胞因子透過血腦屏障，參與局部中樞神經系統炎癥調節［20-21］。在EAE小鼠中，細胞焦亡誘發炎癥，促進T細胞分化為Th1和Th17細胞，加重炎癥及脫髓鞘表現［22］。研究發現，細胞焦亡與MS及EAE密切相關［8，22］，NLRP3炎性小體的激活在細胞焦亡經典途徑中發揮重要作用［23］。caspase-1抑制劑VX-765可抑制其激活，減輕EAE小鼠炎癥反應［24］。本研究發現，與正常對照組相比，EAE小鼠脊髓組織NLRP3 mRNA、caspase-1 mRNA表達明顯升高，外周血IL-1β、IL-18含量顯著增加。說明EAE小鼠的發病機制與NLRP3/caspase-1通路介導的細胞焦亡密切相關。PTX干預后降低了EAE小鼠脊髓組織NLRP3 mRNA、caspase-1 mRNA表達水平及外周血IL-1β、IL-18含量，且劑量越高變化越明顯，說明PTX可能通過抑制NLRP3/caspase-1通路減少細胞焦亡，減輕對EAE小鼠的損傷。

綜上所述，PTX可能通過抑制細胞焦亡減輕EAE小鼠炎癥反應，其機制可能與抑制NLRP3/caspase-1通路有關。PTX對EAE小鼠發揮保護作用的機制是否與其他通路相關有待進一步研究。PTX用于MS的治療尚無明確報道，本實驗可能為MS的治療提供新的方向。

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（2022-07-21收稿 2022-08-15修回）

（本文編輯 李志蕓）