硫利達嗪對胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響及機制探討

羅娜　倪猛　刁云輝

摘要：目的 探討硫利達嗪（TDZ）對胰腺癌細胞SW1990增殖、凋亡的影響及其對LINC00470的調控作用。方法 用不同濃度（5、10、20 μmol/L）的TDZ處理人胰腺癌細胞SW1990，si-NC（si-NC組）、si-LINC00470（si-LINC00470組）轉染至SW1990細胞，分別將pcDNA（TDZ+pcDNA組）、pcDNA-LINC00470（TDZ+pcDNA-LINC00470組）轉染至SW1990細胞后加入TDZ處理細胞；MTT、平板克隆形成實驗檢測細胞增殖及克隆形成能力；流式細胞術檢測細胞凋亡率；實時熒光定量PCR檢測LINC00470的表達量；Western blot檢測活化的胱天蛋白酶（cleaved-caspase）3、cleaved-caspase9蛋白表達。結果 與對照組比較，TDZ不同劑量組SW1990細胞增殖抑制率、凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高，細胞克隆形成數減少，LINC00470的表達量降低（P＜0.05）。與si-NC組比較，si-LINC00470組SW1990細胞增殖抑制率、凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高，細胞克隆形成減少（P＜0.05）。轉染pcDNA-LINC00470可逆轉TDZ對SW1990細胞增殖、凋亡及克隆形成的作用。結論 TDZ可通過抑制LINC00470的表達而抑制胰腺癌細胞增殖、克隆形成及誘導細胞凋亡。

關鍵詞：胰腺腫瘤；硫利達嗪；細胞增殖；細胞凋亡；RNA，長鏈非編碼；LINC00470

中圖分類號：R735.9，R979.1文獻標志碼：ADOI：10.11958/20220932

The effect of Thioridazine on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells

LUO Na NI Meng DIAO Yunhui

1 Department of Western Medicine， 2 Department of Gastroenterology， Nanyang Central Hospital， Nanyang 473000， China

Abstract： Objective To explore the effect of thioridazine （TDZ） on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells SW1990 and its regulatory effect on LINC00470. Methods Different concentrations of TDZ （5， 10 and 20 μmol/L） were used to treat human pancreatic cancer cells SW1990. si-NC and si-LINC00470 were transfected into SW1990 cells （the si-NC group and the si-LINC00470 group）. After transfecting pcDNA and pcDNA-LINC00470 into SW1990 cells， TDZ were added to treat cells （the TDZ+pcDNA group and the TDZ+pcDNA-LINC00470 group）. MTT， plate clone formation test were used to detect cell proliferation and clone formation ability. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate. The real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression level of LINC00470. Western blot assay was used to detect expression levels of activated aspartate specific cysteine protease （cleaved-caspase） 3 and cleaved-caspase9. Results Compared with the control group， the cell proliferation inhibition rate， apoptosis rate， cleaved-caspase3 and cleaved-caspase9 protein levels of SW1990 cells were increased， the number of cell clone formation was decreased， and the expression level of LINC00470 was decreased in the different dose TDZ groups （P＜0.05）. Compared with the si-NC group， the cell proliferation inhibition rate， apoptosis rate， cleaved-caspase3 and cleaved-caspase9 protein levels of SW1990 cells were increased in the si-LINC00470 group， and the cell clone formation was reduced （P＜0.05）. The transfection of pcDNA-LINC00470 could reverse the effect of TDZ on cell proliferation， apoptosis and colony formation of SW1990 cells. Conclusion TDZ can inhibit the proliferation， clone formation and induce apoptosis of pancreatic cancer cells by inhibiting the expression of LINC00470.

Key words： pancreatic neoplasms; Thioridazine; cell proliferation; apoptosis; RNA， long noncoding; LINC00470

胰腺癌是一種消化系統惡性腫瘤，發病率與病死率較高。研究顯示，胰腺癌早期患者癥狀不明顯，大部分患者確診時已處于晚期，5年生存率較低［1］。由于缺乏有效的治療方式，大多數胰腺癌患者死于癌癥進展，因此尋找安全有效且可抑制胰腺癌細胞增殖及轉移的藥物至關重要［2］。硫利達嗪（TDZ）屬于哌啶類衍生物，其在早期主要用于治療精神分裂等精神疾病，后來發現其亦有抗腫瘤作用，有望成為新型抗腫瘤藥物［3］。目前，有關TDZ與胰腺癌的相關研究報道較少。研究顯示，長鏈非編碼RNA（LncRNA）在腫瘤中異常表達，其中LINC00470在胃癌組織和細胞中表達上調，可促進胃癌的發生及發展［4］。然而，鮮見LINC00470在胰腺癌中作用的相關研究。本研究旨在探討TDZ可否通過調控LINC00470表達而影響胰腺癌SW1990細胞的增殖及凋亡，以期為治療胰腺癌提供新的臨床靶向藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 TDZ（純度≥98%）購自美國Sigma公司；人胰腺癌細胞SW1990購自上海通派生物科技有限公司；MTT試劑購自上海碧云天生物有限公司；凋亡檢測試劑盒、Lipofectamine2000購自北京索萊寶科技有限公司；si-NC、si-LINC00470購自廣州銳博生物技術有限公司；pcDNA3.1購自上海生工生物工程股份有限公司；pcDNA-LINC00470購自上海吉滿生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄與實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）試劑購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人活化的胱天蛋白酶3（cleaved-caspase3）、活化的胱天蛋白酶9（cleaved-caspase9）抗體、內參GAPDH抗體與二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組 按照4×103個/孔將SW1990細胞接種于96孔板，分別加入含有5 μmol/L（TDZ低劑量組）、10 μmol/L（TDZ中劑量組）、20 μmol/L（TDZ高劑量組）TDZ的培養液培養24 h［5］。將未經處理的SW1990細胞置于DMEM完全培養基內培養24 h（對照組）。用脂質體Lipofectamine2000分別將si-NC（si-NC組）、si-LINC00470（si-LINC00470組）轉染至SW1990細胞。分別將pcDNA（TDZ+pcDNA組）、pcDNA-LINC00470（TDZ+pcDNA-LINC00470組）轉染至SW1990細胞后，加入含有20 μmol/L TDZ的培養液培養24 h。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率 取1.2.1各組SW1990細胞，按照每孔3 000個細胞的密度接種于96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，培養4 h后棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育10 min后用酶標儀檢測各孔450 nm波長處光密度（OD）值，并計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。每次設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 取1.2.1每組SW1990細胞（1×103個/孔）接種于6孔板，培養36 h后收集細胞并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，加入含有體積分數10%的胎牛血清且不含抗生素的培養液，將細胞接種于12孔板（100個/孔），于培養箱內繼續培養2周。用4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結晶紫染色1 min，顯微鏡下計數每個視野各孔的細胞克隆形成數。每次設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取1.2.1中處理后的各組SW1990細胞，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞后加入5 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），充分混勻后加入5 μL碘化丙啶（PI），室溫避光孵育10 min后用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每次設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.5 qRT-PCR檢測LINC00470相對表達水平 用Trizol試劑提取1.2.1中每組SW1990細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作，用逆轉錄試劑盒將RNA合成cDNA。以cDNA為模板配置qRT-PCR反應體系：cDNA 4 ?L，上下游引物各0.4 ?L，SYRB Mix 10 ?L，ddH2O 5.2 ?L，共20 ?L。用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增。反應條件：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算LINC00470相對表達水平。引物序列依據參考文獻［6］設計，LINC00470：上游5′-AGACACAGCCTCTACTGTACT-3′，下游5′-CCTCGTCACCTTACGTCAATAC-3′；β-actin：上游5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游5′-AGGGAGGAGCTGGAAGCAG-3′。每次設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達 將1.2.1中每組SW1990細胞充分裂解后離心吸取上清液，提取細胞總蛋白，蛋白與上樣緩沖液充分混合后加熱，促使蛋白變性，依次用5%濃縮膠和10%分離膠進行SDS-PAGE。轉膜后用5%脫脂牛奶阻斷膜，加入cleaved-caspase3（1∶1 000）、cleaved-caspase9（1∶1 000）、GAPDH（1∶3 000）一抗孵育過夜，清洗后加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，用ECL化學發光試劑盒檢測蛋白，用凝膠系統全自動化學發光成像儀分析結果。每次設置3個復孔，實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TDZ對胰腺癌SW1990細胞增殖的影響 與對照組比較，TDZ低、中、高劑量組細胞增殖抑制率依次升高，細胞克隆形成數依次降低（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 TDZ對胰腺癌SW1990細胞凋亡的影響 與對照組比較，TDZ低、中、高劑量組細胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達水平依次升高（P＜0.05），見圖2、3，表2。

2.3 TDZ對胰腺癌SW1990細胞LINC00470表達的影響 對照組、TDZ低劑量組、TDZ中劑量組、TDZ高劑量組LINC00470相對表達水平分別為（1.00±0.00）、（0.79±0.05）、（0.59±0.05）、（0.42±0.04）。與對照組比較，TDZ低、中、高劑量組LINC00470的表達量依次降低（n＝9，F＝342.909，P＜0.05）。

2.4 干擾LINC00470表達對胰腺癌SW1990細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC00470組細胞增殖抑制率升高，細胞克隆形成數減少，凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白相對表達水平升高（P＜0.05），見圖4、5，表4。

2.5 LINC00470過表達對胰腺癌細胞增殖和凋亡的作用 與TDZ+pcDNA組比較，TDZ+pcDNA-LINC00470組細胞增殖抑制率降低，細胞克隆形成數增多，凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖6、7，表5。

3 討論

TDZ影響多種癌細胞的增殖和凋亡。研究顯示，TDZ可抑制乳腺癌細胞增殖并促進其凋亡［7］。TDZ可通過調控腫瘤細胞凋亡，從而增強肺癌和卵巢癌細胞的順鉑敏感性［8］。TDZ可抑制鼻咽癌細胞增殖［9］。本研究結果亦顯示，低、中、高劑量TDZ均可抑制胰腺癌SW1990細胞增殖，并降低胰腺癌SW1990細胞克隆形成數，尤其是TDZ高劑量具有抗胰腺癌增殖的作用。癌細胞的異常凋亡會激活體內線粒體途徑，使caspase3、caspase9活化為cleaved-caspase3、cleaved-caspase9，加速癌細胞凋亡的發生［10-11］。本研究結果顯示，隨著TDZ濃度的不斷增加，胰腺癌SW1990細胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達水平均依次升高，表明不同劑量TDZ均能上調cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達，并提高胰腺癌SW1990細胞凋亡率，尤其是高劑量組促凋亡作用更為明顯，但TDZ調控胰腺癌細胞增殖及凋亡的分子機制仍需進一步探究。

LncRNA是哺乳動物轉錄組的主要組成部分，其作為腫瘤治療潛在靶點的高效應用已受到廣泛關注［12］。研究表明，LINC00470可通過調控miR-134/Myc分子軸而促進神經膠質瘤細胞遷移及侵襲［13］。LINC00470在肝細胞癌中呈高表達，并可促進肝癌細胞增殖［14］。本研究結果顯示，干擾LINC00470表達后胰腺癌SW1990細胞增殖抑制率升高，克隆形成數減少，SW1990細胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高，表明干擾LINC00470表達可抑制胰腺癌SW1990細胞增殖并促進其凋亡，提示LINC00470可能在胰腺癌細胞進展中發揮重要作用。此外，本研究發現，隨著TDZ濃度的增加，胰腺癌SW1990細胞中LINC00470的表達量依次降低，提示TDZ可能通過抑制LINC00470的表達而發揮抗胰腺癌SW1990增殖和促進其凋亡的作用。為進一步證實TDZ與LINC00470在胰腺癌細胞增殖和凋亡中的調控關系，本研究在過表達LINC00470的基礎上對胰腺癌SW1990細胞進行TDZ干預，結果提示LINC00470過表達能夠拮抗TDZ對胰腺癌細胞增殖及凋亡的作用。

綜上所述，TDZ可通過下調LINC00470表達來抑制胰腺癌細胞增殖，并促進其凋亡。LncRNA常通過調控下游miRNA水平影響腫瘤細胞的增殖、凋亡，而介導LINC00470功能的下游靶miRNA尚需進一步預測和驗證。本研究初步論證了TDZ對胰腺癌細胞生物學行為的影響，為胰腺癌藥物的研發提供新方向，為進一步揭示TDZ抗胰腺癌作用奠定了實驗基礎。

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（2022-06-21收稿 2022-09-20修回）

（本文編輯 陸榮展）