miRNA對口腔鱗狀細胞癌化療耐藥性的調控機制研究

翟文靜,仇永樂,劉珊珊,劉鐵軍,呂飛飛

(1.河北省石家莊市人民醫院口腔科,河北 石家莊050000;2.河北醫科大學第四醫院口腔科,河北 石家莊 050017;3.河北大學附屬醫院口腔科,河北 保定 071000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的頭頸部腫瘤之一,占口腔惡性腫瘤總數的90%[1]。OSCC患者的5年生存率為60%～80%,未確診患者的生存率低于50%[2]。輔助治療在治療晚期癌癥方面發揮重要作用[3],而這種預治療僅對部分患者有效[4]。目前為止,還沒有可靠的生物標志物來評估患者對該療法或腫瘤生物學特征的反應。微核糖核酸(microRNA,miRNA)是小片段非編碼單鏈內源RNA分子,能夠識別并參與調控化療耐藥性。引起化療耐藥的原因涉及多個方面,如藥物的跨膜運輸[5],細胞內藥物代謝[6]或細胞增殖和凋亡[7]。miRNA可調節轉錄后全基因組表達[8],并參與操控諸多細胞活動,包括細胞分化、增殖、凋亡和新陳代謝[9]。此外,miRNA與癌癥[10]對化療的敏感性[11]已被廣泛研究,而未見關于耐藥口腔鱗癌的系統性分析。本研究旨在系統的檢測耐藥細胞系中特征性miRNA與耐藥化療表型的相關性。此外,課題組還進一步驗證這些特征性miRNA是否影響口腔鱗癌細胞系的生物學行為。最后,研究這些特征性miRNA對細胞內通路的調節作用,探討這種調控作用與化療耐藥性的相關性。

1 材料與方法

1.1細胞培養 OSCC細胞系SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R(DSMZ,德國)采用標準培養基和操作流程進行培養[12]。在3個細胞系中研究miRNA對OSCC細胞系化療耐藥性的影響。在2個細胞系(SCC084/R,SCC9/R)中研究miRNA對OSCC細胞系凋亡和細胞周期的影響。在SCC084/R、SCC9/R細胞中進行靶點分析。

1.2miRNA的篩選與表達調控 從耐藥OSCC細胞特征性miRNA中篩選出研究較為深入的miR-125a-5p、miR-130a-3p和miR-27b-5p進行研究。在順鉑耐藥的OSCC細胞中,miR-27b-5p能顯著提高其藥物敏感性[13]。此外,miR-130a-3p能影響口腔鱗癌耐藥細胞系對順鉑和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的敏感性[14]。miRNA通過脂質體LipofectamineTM2000(Life Technologies,Carlsbad,美國)瞬時轉染[15]。本研究通過轉染miR-125a-5p模擬物(miR-125a-5p M),miR-27b-5p模擬物(miR-27b-5p M),miR-130a-3p抑制劑(miR-130a-3p I),上調靶細胞中miR-125a-5p和miR-27b-5p的表達,降低miR-130a-3p的表達,以空質粒轉染組(Sham)為作為對照。miRNA的模擬物/抑制劑購自Qiagen(德國)。聯合轉染用于研究miRNA共轉染對耐藥細胞系的生物學影響。通過qRT-PCR(Beckman Coulter,美國)評估轉染水平[15],SNORD25、SNORD68和RNU6B(Qiagen,德國)作為管家基因。

1.3化療處理和活力測定 轉染后24 h用順鉑和5-FU進行化療。72 h使用MTT檢測(Sigma Aldrich,美國)[15]進行活力測定,細胞生存率越低,說明藥物越敏感,所有實驗組一式四份。

1.4凋亡和細胞周期分析 miRNA對細胞凋亡的影響和細胞周期在轉染后48 h進行檢測[凋亡:FITC Annexin V/7-AAD 凋亡試劑盒(BioLegend,英國)];根據說明書使用Beckman Coulter FC500(Beckman Coulter,美國)流式細胞儀測試,細胞數=20 000,使用CXP-軟件(Beckman Coulter,美國)進行數據采集,早期凋亡(Annexin V陽性和7AAD陰性)和晚凋亡細胞(Annexin V和7AAD陽性):所有實驗組一式四份。

1.5靶點分析 選擇來自miRNA靶基因預測數據庫TargetScan的不同miRNA的潛在目標基因,Total Context score≤0.5:Bcl-2,BIM,X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)、絲裂原和應激激活蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1,MSK-1)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1,MDR1)、DNA(胞嘧啶-5)甲基轉移酶[DNA (Cytosine-5)-methyltransferase 1,DNMT1]、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARy)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,ErbB2/Her2)、p53和組蛋白脫乙酰酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)。進一步分析凋亡通路的下游靶點caspase 3(Casp3),caspase 9(Casp9),Tubulin-β-3為對照組。

一抗購自Invitrogen(美國),二抗使用抗兔 HRP 和抗鼠HRP(A6154,A9044:Sigma-Aldrich)。細胞在轉染48 h后收集,將15～30 μg蛋白加入到6%～10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)變性聚丙烯酰胺凝膠上。隨后將蛋白質轉移置PVDF膜上,封閉。一抗4 ℃下孵育過夜,清洗,二抗孵育。用ECL-plus-Western blotting檢測系統檢測條帶生成(Immobilon,Millipore,美國)。

1.6統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1耐藥OSCC特征性miRNA對化療耐藥性的影響 順鉑化療組中,miR-27b-5p上調組SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細胞生存率低于Sham組,miR-130a-3p下調組SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細胞生存率低于Sham組,miR-125a-5p上調組SCC9/R細胞生存率低于Sham組,差異有統計學意義(P<0.05)。說明,miR-27b-5p上調提高了SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細胞對順鉑的敏感性。miR-130a-3p下調提高了SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細胞對順鉑的敏感性,miR-125a-5p上調提高了SCC9/R細胞對順鉑的敏感性。FU化療組中,miR-27b-5p上調組SCC9/R細胞生存率低于Sham組,miR-130a-3p下調組SCC084/R細胞生存率低于Sham組,miR-125a-5p上調組SCC131/R和SCC09/R細胞生存率高于Sham組,差異有統計學意義(P<0.05)。說明,miR-27b-5p上調組提高了SCC9/R細胞對5-FU的敏感性;miR-130a-3p下調提高了SCC084/R細胞對5-FU的敏感性,miR-125a-5p上調降低了SCC131/R和SCC09/R細胞對5-FU的敏感性。見表1。

表1 單獨轉染miRNA對化療后細胞毒性的調控作用

2.2共轉染對順鉑耐藥性的增效/拮抗效應 評估miR-27b-5p、miR-130a-3p和miR-125a-5p對化療藥物增敏作用的潛在增效/拮抗作用。通過上調miR-27b-5p表達,同時上調miR-125a-5p或下調miR-130a-3p表達,檢測miRNA共轉染對順鉑和5-FU化療敏感性的影響。

在順鉑用藥組中,miR-130a-3p 下調/miR-27b-5p上調組中SCC084/R和SCC131/R細胞的生存率低于miR-130a-3p下調和miR-27b-5p上調組,差異有統計學意義(P<0.05)。說明在SCC084/R和SCC131/R細胞中,共轉染的增效作用高于單個miRNA轉染組。miR-125a-5p上調/miR-27b-5p上調組的SCC084/R和SCC131/R細胞生存率低于單個miRNA轉染組,差異有統計學意義(P<0.05)。說明miR-125a-5p上調/miR-27b-5p上調共轉染組在SCC084/R和SCC131/R細胞中增效作用高于單個miRNA轉染組,見表2。

表2 共轉染miRNA對化療后細胞毒性的調控作用

在5-FU用藥組中,與單個轉染組相比,miR-130a-3p下調/miR-27b-5p上調組未顯示出明顯的增效作用(P>0.05)。與單個轉染組相比,miR-125a-5p上調/miR-27b-5p上調組在SCC084/R和SCC9/R細胞中顯示出顯著增效作用(P<0.05),見表2。

2.3miRNA對耐藥OSCC凋亡和細胞周期影響 所選miRNA的表達水平改變顯著提高細胞凋亡水平,特別是晚期凋亡率。在SCC084/R細胞中,miR-27b-5p上調組、miR-125a-5p上調組早期凋亡率高于Sham組,miR-130a-3p下調組、miR-27b-5p上調組、miR-125a-5p上調組晚期凋亡率高于Sham組,差異有統計學意義(P<0.05)。在SCC131/R細胞中,miR-130a-3p下調組、miR-27b-5p上調組、miR-125a-5p上調組早期凋亡率和晚期凋亡率高于Sham組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 miRNA轉染對耐藥OSCC細胞凋亡誘導作用

在SCC084/R細胞中,miR-125a-5p上調組、miR-130a-3p下調組G1期比例低于Sham組,差異有統計學意義(P<0.05)。在SCC131/R細胞中,miR-125a-5p上調組G1期比例低于Sham組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 miRNA轉染對耐藥OSCC細胞周期的影響

2.4miRNA表型對OSCC耐藥通路的作用 為檢測所選miRNA對下游信號通路的影響,分析了一些潛在靶點。Western blotting分析表明,在SCC131/R中,相對于Sham組,miR-125a-5p上調組會降低DNMT1,MSK-1,Bcl-2和Bim的蛋白水平表達,差異有統計學意義(P<0.05)。相對于Sham組,miR-130a-3p下調組MDR-1和Bcl-2蛋白水平下調,XIAP蛋白水平上調(P<0.05)。相對于Sham組,增加miR-27b-5p的表達水平導致ErbB2和HDAC4的蛋白水平下降,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1,表5。由于上述通路大部分能靶向調控終端凋亡信號,隨后進一步分析下游凋亡通路,Caspase 3和Caspase9的表達水平。研究發現,相對于Sham組,miR-130a-3p下調組,miR-27b-5p上調組,miR-125a-5p上調組,均能上調SCC131/R和SCC084/R細胞中Caspase 3和Caspase9蛋白的表達,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2,表6。

圖1 miRNA轉染對耐藥OSCC細胞內蛋白表達的影響

圖2 miRNA轉染對耐藥OSCC細胞內凋亡蛋白表達的影響

表5 miRNA轉染對耐藥OSCC細胞內蛋白表達的調控作用

表6 miRNA轉染對耐藥OSCC細胞內凋亡蛋白表達的調控作用

在SCC084/R細胞中相對于Sham組,miR-125a-5p上調組會降低DNMT1,Bcl-2及Bim的蛋白水平表達,差異有統計學意義(P<0.05)。相對于Sham組,miR-130a-3p下調組MDR-1和Bcl-2蛋白水平下調,XIAP蛋白水平上調(P<0.05)。相對于Sham組,增加miR-27b-5p的表達水平導致ErbB2和HDAC4的蛋白表達下調,同時p53的蛋白水平上調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1,表5。由于上述通路大部分能靶向調控終端凋亡信號,隨后進一步分析下游凋亡通路,Caspase 3和Caspase9的表達水平。研究發現,相對于Sham組,miR-130a-3p下調組,miR-27b-5p上調組,miR-125a-5p上調組,均能上調SCC131/R和SCC084/R細胞中Caspase 3和Caspase9蛋白的表達,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2,表6。

3 討 論

化療耐藥嚴重影響OSCC患者的預后。識別或預后不良反應監測對于患者能否得到個性化治療及其重要。Rajan等[16]對耐藥OSCC中特征性miRNA表達識別的研究表明,miRNA在OSCC的化療耐藥性和腫瘤生物學的表觀遺傳調節中可能起關鍵作用。

本研究的數據證明耐藥OSCC中特征性miRNA是導致該腫瘤的抗化療表型的原因之一。通過分析3個耐藥OSCC細胞系中的3個miRNA證實,在三個細胞系中miR-125a-5p、miR-27b-5p和miR-130a-3p能顯著影響癌細胞對順鉑的敏感性。而僅在SCC084/R的測試細胞系中,對5-FU的敏感性顯著提高。此外,三個miRNA的轉染都能影響細胞凋亡,可導致部分細胞G1期阻滯。Western blotting結果表明,這些miRNA在不同的耐藥性相關通路中調控多個靶點,包括凋亡的p53通路、DNA甲基化或組蛋白修飾。由于Bcl-2和p53都是凋亡依賴性通路的一部分,數據表明,miRNA不僅針對幾個不同的耐藥性相關通路,還針對單個通路中的不同關鍵蛋白質。關于在凋亡信號中下游靶點Caspase 3和Caspase9的表達進一步驗證了上述觀點。

本研究的miRNA與許多其他癌癥的化療耐藥性有關,但部分結果相互矛盾:miR-125可提高宮頸癌對紫杉醇與順鉑的敏感性[17]但會增加胰腺癌對Gemcitabine 的耐藥性[18]。miR-130a的高表達與肝癌[19]對Gemcitabine的敏感性增加有關,而其他報道顯示miR-130a增加了卵巢癌中鉑基化療的耐藥性[20]。miR-27b的下調能增加胃癌的多藥耐藥性[21],同時miR-27b的上調能提高順鉑耐藥口腔鱗癌的化療敏感性[22]。

本研究中,miRNA對順鉑或5-FU治療的不同影響可能是由這兩種藥物的具體作用機制引起的,5-FU是一種經典的抗代謝藥物。這些藥物可抑制必要的生物合成過程,與DNA和(或)RNA結合,并損害其正常功能。順鉑通過與細胞核和細胞質信號通路中的復雜相互作用發揮其抗癌功能。本研究中選擇的miR-125a-5p、miR-27b-5p、miR-130a-3p能作用于Bcl-2 和 p53通路,它們的主要作用與對順鉑相關,與5-FU的相關性不明顯。

最后,同時操縱兩個miRNA的表達水平,在50%(miR-125a-5p/miR-130a-3p)和83%(miR-130a-3p/miR-27b-5p)的測試細胞系中表現出對治療的增敏效果。與miRNA共同轉染的實驗數據較為有限[23]。Zheng等[24]研究表明,與miR-125b和miR-141模擬物,增加了乳腺癌細胞系對Taxane-Anthracycline的耐藥性。Wang等[25]研究表明,聯合抑制以下兩個miRNA(miR-125a,miR-125b,miR-205)降低了Entinostat對乳腺癌細胞的凋亡作用。這些數據初步揭示了miRNA對化療耐藥的協同調控作用。

由于體外細胞不能完全反映遺傳背景下人腫瘤的異質性,該模型的臨床參考價值有限。本研究通過使用三種不同的耐藥OSCC細胞系來“模仿”臨床樣本中的人腫瘤細胞的變異性來解決上述問題。此前諸多項研究表明miRNA能影響大多數細胞系的化療耐藥性,這表明本研究觀察到的結果不局限于單個OSCC耐藥細胞系。