血漿cfDNA評估原發性肝癌患者放療效果的臨床研究

袁小鵬　王向前　易瓊　陸紅梅　楊百霞　楊燕光

[摘? ?要]? ?目的：分析原發性肝癌患者放療前后血漿游離核酸（cell-free DNA，cfDNA）濃度變化，探討cfDNA對原發性肝癌放療效果的評估作用。方法：行放射治療的中晚期原發性肝癌患者40例，在放療前24 h、放療后48 h、40 Gy時及放療結束時測定患者血漿中cfDNA、血清中甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）、谷丙轉氨酶（alanine amintransferase，ALT）及谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）濃度，并在放療前、放療40 Gy時同時行MRI/CT檢查，評估腫瘤大小的變化。結果：患者放療后48 h血漿cfDNA濃度與基線值比值>1，為2.38±0.33，提示cfDNA濃度一過性升高，但在放療40 Gy時及放療結束時血漿cfDNA濃度與基線值比值均<1，分別為0.30±0.07和0.25±0.05，與放療前比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。患者放療后48 h、40 Gy時及放療結束時血清AFP與基線值比值均<1，分別為0.65±0.13、0.19±0.08和0.14±0.06，呈逐漸下降趨勢，放療40 Gy時及放療結束時與放療前比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。放療40 Gy時腫瘤直徑與基線值比值為0.65±0.15，提示腫瘤較放療前縮小。患者放療后48 h、40 Gy時及放療結束時血清ALT及AST濃度與基線值比值均接近1，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：聯合檢測血漿cfDNA和血清AFP濃度有助于評估原發性肝癌的放療效果。

[關鍵詞]? ?游離核酸；原發性肝癌；放射治療；甲胎蛋白

[中圖分類號]? ?R735.7 [文獻標志碼]? ?B [DOI]? ?10.19767/j.cnki.32-1412.2023.04.013

全球原發性肝癌發病率位居惡性腫瘤第6位，死亡率位居第2位，約55%新發病例發生在我國[1]。原發性肝癌主要為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），治療方式包括手術、介入、分子靶向、放射治療、免疫治療等[2-3]。隨著放療技術的不斷發展，放射治療在小肝癌、中晚期肝癌治療中的地位日趨重要[4]，治療方式也由姑息性放療逐漸向根治性放療轉變。由于受放療敏感性和耐受性的影響，仍有部分患者療效不佳。血清甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）在肝癌診斷、療效監測中具有重要作用，但靈敏度和特異度有限[5]。因此，尋找更加有效、準確和檢測方便的生物標記物尤為重要。目前，液體活檢對提高肝癌早期發現、改善患者預后、提高生存率及生存質量的重要作用得到廣泛關注，其中血漿游離核酸（cell-free DNA，cfDNA）是目前研究的熱點之一[6-7]。本研究選擇我院2019年1月—2021年6月確診并進行放射治療的40例中晚期原發性肝癌患者，通過聯合檢測患者放療不同階段血漿cfDNA和血清AFP濃度，評估放療對原發性肝癌的治療效果。

1? ?資料與方法

1.1? ?一般資料? ?中晚期原發性肝癌患者40例，其中男性22例，女性18例，年齡18～75歲，平均55.0±6.3歲。納入標準：（1）根據巴塞羅那分期和國際抗癌聯盟UICC 2017年TNM分期（第8版）為中晚期手術不可切除的原發性肝癌，Child-Pugh 肝功能分級A/B級，體力狀況PS評分0～2分；（2）病理檢查證實為肝細胞癌；（3）至少有一個腫瘤病灶可以準確測量大小，且該病灶既往未接受過局部治療；（4）預期生存期≥12周；（5）無心、腦、腎等主要臟器功能障礙。排除標準：（1）彌漫性肝內病變，無法行放射治療者；（2）既往患有或同時存在其他惡性腫瘤；（3）合并嚴重感染；（4）入組前1個月內有消化道出血者；（5）臨床資料不完整或未完成全部治療者。本研究經醫院倫理委員會審核批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2? ?放療計劃? ?患者仰臥位，真空墊固定體位，訓練患者平靜呼吸。采用螺旋CT 5 mm層距連續增強掃描定位，掃描范圍自膈頂上3 cm至右腎下極，將CT圖像資料和相關數據輸入TPS治療計劃系統進行設計。采用定位CT和MRI圖像融合技術，在定位CT窗寬400、窗位40進行勾畫，畫出大體腫瘤體積（GTV）和周邊危及器官（organs at risk，OAR），并根據解剖結構及屏障作相應修改，確定臨床靶體積（CTV）及計劃靶區（PTV）。放射治療處方劑量：腫瘤直徑≤5 cm，48～60 Gy /8～10 f，3次/周；腫瘤直徑>5 cm，40～54 Gy /10～15 f，5次/周。優化指標：≥50%的等劑量曲線包繞PTV；靶區周圍危及器官如胃腸道、脊髓的劑量不超過耐受劑量；接受>30 Gy劑量照射的正常肝臟體積（V30）達到最小化（均<30%）；病灶≤5.0 cm采用立體定向體部放療（stereotactic body radiation therapy，SBRT），>5.0 cm采用調強放療（intensity-modulated radiation therapy，IMRT）。

1.3? ?實驗室檢測? ?在放療前24 h、放療后48 h、放療40 Gy及放療結束時取患者血液置入EDTA抗凝采血管，室溫，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血漿600 μL，轉移至1.5 mL離心管中，PBS稀釋后4 ℃下3 000 r/min離心1 min，取上清液。使用Quanti DNA Direct cfDNA檢測試劑盒（南京帝基生物科技有限公司），參照說明書測定上清液中cfDNA濃度。同時由我院中心實驗室測定患者血清AFP、谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平。

1.4? ?影像學檢查? ?在放療前及放療40 Gy時作增強MRI（1.5T）檢查，螺距為5 mm。

1.5? ?統計學處理? ?應用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2? ?結? ? ? 果

2.1? ?原發性肝癌患者放療不同時間段cfDNA、AFP、腫瘤直徑變化? ?計算放療后各時間點cfDNA、AFP、腫瘤直徑與基線值（放療前24 h）的比值，比值<1表示放療后測定的數值較放療前下降，>1表示放療后測定的數值較放療前升高。結果顯示，不同性別、年齡、腫瘤直徑、HBV-DNA感染狀態患者以及統計所有患者放療后48 h、放療40 Gy時及放療結束時血清AFP與基線值比值均<1，且呈現逐漸下降趨勢，放療40 Gy時及放療結束時與放療前比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。而cfDNA濃度在放療后48 h時與基線值比值>1，提示cfDNA濃度短期內一過性升高，在放療40 Gy時明顯下降，放療結束時進一步下降，與基線值比值均<1，與放療前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。放療40 Gy時腫瘤直徑與基線值比值均小于1，與放療前比較差異有統計學意義（P<0.05），提示腫瘤較放療前縮小。見表1。

2.2? ?原發性肝癌患者放療不同時間段ALT、AST濃度變化? ?不同性別、年齡、腫瘤直徑、HBV-DNA感染狀態患者以及所有患者放療后48 h、40 Gy時及放療結束時血清ALT及AST水平與基線值比值均接近1，差異均無統計學意義（P>0.05），提示放療后患者血清ALT及AST濃度無明顯變化。見表2。

3? ?討? ? ? 論

cfDNA主要是程序性細胞死亡或急性細胞損傷時釋放的DNA片段，可間接反映細胞損傷的程度[8]。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是目前cfDNA研究最深入的分支，主要來自壞死或凋亡的腫瘤細胞、腫瘤細胞外泌體及循環腫瘤細胞，可用于檢測點突變及獲得性耐藥的突變基因，指導耐藥后用藥[9-10]。由于患者外周血中ctDNA含量較低，不易提取和鑒定，且檢測操作復雜，成本較高，臨床應用受到限制。研究表明，血漿cfDNA含量與ctDNA呈正相關[11]。健康人血液中可檢測到低濃度cfDNA，而在肺癌、結直腸癌、乳腺癌和卵巢癌等患者血液中cfDNA顯著增加，可為腫瘤遺傳學、進展機制和耐藥性研究提供信息[12]。通過檢測cfDNA水平可間接反映腫瘤細胞死亡數量及機體損傷程度，方法準確快速、便捷高效、靈敏度和特異度高，且價格低廉。

HBV相關肝細胞癌患者同時處于乙肝導致的機體炎癥反應和肝細胞癌兩種狀態。研究表明，在不同HBV-DNA病毒復制水平、CTP分級、TNM分期、腫瘤數目、血管是否侵犯HCC患者之間cfDNA濃度的差異均有統計學意義（P<0.05），并且cfDNA濃度與血清白蛋白濃度、血小板計數、腫瘤大小呈線性相關[13]。研究發現，HCV相關HCC患者血清cfDNA水平明顯高于HCV攜帶者，接受治療性肝切除術的cfDNA高水平患者總生存期（OS）較低水平患者明顯縮短（P=0.017），同時血清cfDNA是OS和遠處轉移的預測因子[14]。研究表明，檢測cfDNA水平對監測HCC患者療效具有一定價值，cfDNA高表達組患者5年生存率較cfDNA低表達組低（P<0.05），無進展生存期（progression-free survival，PFS）較cfDNA低表達組縮短（P<0.05）[15]。已有研究利用實時定量PCR測定130例胃癌患者血清或血漿中cfDNA濃度，顯示血漿中cfDNA濃度較血清更低，濃度變化范圍更穩定，說明血漿cfDNA更合適作為cfDNA的檢測樣品[16]。

本研究結果顯示，放療后短期內血漿cfDNA濃度一過性升高，提示腫瘤細胞對放療敏感，壞死后從細胞內釋出，隨著放射線對腫瘤細胞大量殺傷，體內腫瘤負荷降低，導致血漿cfDNA濃度不斷降低，同時MRI復查顯示腫瘤直徑同步縮小。放療后各時間點血清AFP與基線值比值逐漸下降，與cfDNA聯合檢測對肝癌放療效果有一定的預測作用。血清ALT、AST水平在放療前后無顯著變化，說明所采取的放療方案對肝臟的損傷較輕。

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[收稿日期] 2022-07-26

（本文編輯? ?趙喜）