循環miRNA-208a在射血分數降低性心力衰竭的診斷價值研究

龔 倩, 黎 東, 李 郁, 羅彩東

(四川省綿陽市中心醫院心血管內科, 四川 綿陽 621000)

心力衰竭(heart failure,HF)是各種心臟功能或結構異常導致心室射血或充盈能力受損的心臟疾病,發病率高,發達國家成年人HF的患病率約2%,≥75歲人群HF患病率在10%以上,終生風險約20%[1]。射血分數降低性心力衰竭(heart failure with reduced ejection fraction,HFrEF)是由缺血或其他損傷導致心肌細胞喪失的結果,且伴有心肌重塑[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類穩定的、小的非編碼RNA,長約21～25個核苷酸,是人體內正常基因表達的產物,在基因表達調控中發揮重要作用[3]。miRNA已被證實參與HF的病理過程,且在人體循環中存在的形式非常穩定,因而開啟了外周血循環miRNA作為心血管疾病生物學標志物的可能性[4]。本研究檢測HF患者血循環中的miRNA-208a表達水平,以分析探討其在診斷HFrEF中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2021年1月至2022年12月我院心血管內科收治的120例HF患者,其中HFrEF患者56例納入HFrEF組,非HFrEF患者64例納入非HFrEF組。納入標準:①符合《中國HF診斷和治療指南2018》[5]中HF的診斷標準;②有心臟病病史,存在氣短、乏力、端坐呼吸、運動耐量下降、夜間陣發性呼吸困難、雙側踝部水腫及勞力性呼吸困難等癥狀;經實驗室檢查[氨基末端腦鈉肽前體(amino-terminal probrain natriuretic peptide,NT-proBNP)>125pg/mL]、臨床檢查(6min步行試驗<450m)及超聲心動圖檢查[左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)<40%]確診為HF;③年齡>18歲。排除標準:①孕婦或哺乳期女性;②有家族性或先天性心臟病史;③長期服用激素、糖尿病;④合并重要臟器嚴重受損;⑤并發心肌炎、心肌梗死等疾病;⑥認知功能障礙;⑦感染類、血液系統或免疫系統疾病;⑧精神疾病、惡性腫瘤。HFrEF組年齡47～72歲,平均年齡(63.69±5.57)歲;男35例,女21例。非HFrEF組年齡48～73歲,平均年齡(63.91±4.32)歲;男40例,女24例。另選取同期同齡體檢者(無氣促、胸悶、胸痛史,無HF等疾病)60例為對照組。年齡45～70歲,平均年齡(64.07±4.59)歲;男37例,女23例。三組人群年齡、性別、體質量指數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經綿陽市中心醫院生物醫學倫理委員會批準(S20200434-01),入組人群均自愿參與并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑:超凈工作臺(蘇州蘇信凈化設備廠),低溫高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司,型號:TGL-18M),超聲診斷儀(荷蘭飛利浦,型號:EPIQ7C),逆轉錄儀(德國Eppendorf公司),RT-PCR儀(美國Bio-Rad IQ5),紫外分光光度計(Thermo fisher),電化學發光儀(羅氏,型號:C601)。miRcute miRNA Isolation Kit(DP501)購于天根生化科技(北京)有限公司,miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit購于天根生化科技(北京)有限公司,miRcute miRNA qPCR Detection kit購于天根生化科技(北京)有限公司,人類miRNA-208a引物、U6較準品、人類U6引物購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3檢測指標及方法

1.3.1血液標本收集和保存:使用EDTA抗凝管收集所有受檢者空腹(>12h)靜脈血6mL,靜置1h,4℃,3000r/min離心10min,取上清液繼續離心,4℃,12000r/min離心10min,收集上清液于-80℃低溫冷凍保存。

1.3.2心功能測定:患者平臥且平靜呼吸,應用超聲心動圖檢測心功能指標,包括:LVEF、左心室縮短分數(left ventricular fraction shortening,LVFS)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左心房直徑(left atrial diameter,LAD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)、舒張末期室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST),左心室質量(left ventricular mass,LVM)(g)=0.832[(LVEDD+IVST+ LVPWT)3-LVEDD3]+0.6;體表面積(body surface area,BSA)=0.0061×身高(cm)+0.0128×體質量(kg)-0.1529;左心室質量指數(left ventricular mass index,LVMI)(g/m2)=LVM/BSA。所有受檢者超聲心動圖檢查由至少2名經驗豐富的影像科醫師完成。

1.3.3RT-PCR技術檢測miRNA-208a、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA。

1.3.3.1檢測前準備:①提前將超凈工作臺消毒,槍頭高壓滅菌,準備好各種實驗儀器;②將待檢測血液標本取出,室溫融化;③按照試劑盒說明書配好各個濃度的試劑。

1.3.3.2總RNA的提取:miRNA常溫下較容易分解成18～25個核苷酸組成的單鏈,由于分子量相對較小,導致傳統Trizol法提取總RNA較困難,故本實驗采用的是天根生化科技(北京)有限公司反復實驗驗證的,專門用于提取miRNA的試劑盒(miRcute miRNA Isolation Kit)進行總RNA的提取,Nanodrop測定總RNA濃度并進行純度評估,使用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA純度和完整性,而后立即進行下一步檢測,或存于-80℃冰箱中待測。

1.3.3.3總miRNA逆轉錄合成cDNA:miRNA分子鏈較短,故對3＇末端進行poly(A)修飾以延長其長度,提高逆轉錄效率。提取4μL的中RNA按說明書配置反應液:Total RNA 4μL+E.coli Polymerase(5U/μL) 0.4μL +10×Poly(A) Polymerase Buffer 2μL + 5×rATP Solution 4μL +RNase-Free ddH2O 9.6μL,混勻反應液,離心15s,37℃下充分反應1h;去上述反應液2μL,配置反應液:Poly(A)反應液 2μL + 10×RT Primer2μL +10×RT Buffer 2μL + Super Pure dNTPs(2.5mM each) 1μL + RNasin(40U/μL) 1μL + Quant RTase 0.5μL + RNase-Free ddH2O 9.6μL,混勻反應液,離心15s,37℃下充分反應1h進行cDNA合成。

1.3.3.4熒光定量檢測:從miRBase網站http://www.mirbase.org/查詢得到miRNA-208a的核苷酸序列信息(見圖1),miRNA-208a、β-MHC及U6引物序列購于天根生化科技(北京)有限公司,miRNA-208a引物:sense 5'-GTCAGTTTGTCAAATACC-3',antisense 5'GAGCAGGCTGGAGAATAG3';β-MHC引物:sense 5'- TGGAGTACAAAAAGCTGCTG- GAACG-3',antisense 5'-AGCTCAGCATTCATCTTCC-3';U6引物:sense 5'- ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3';antisense 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。按說明書配置總反應液:2×miRcute miRNA Premix(with SYBR & ROX)10μL + Reverse Primer(10uM)0.4μL + RNase-FreeddH2O 8.2μL,配置33份反應液,取18.6μL分裝入4排8聯管,各排加入上述反應合成的cDNA,第一、二排用于檢測miRNA-208a,第三、四排用于檢測內參U6,第一、二排加入miRNA-208a引物,第三、四排加入U6引物。混勻上述反應液進行PCR擴增,反應條件設定:起始模板變性:1×(94℃,2min);PCR循環中變性、退火、延伸反應條件:45個循環×(94℃,20s;60℃,34s)。實驗進行三次,待反應結束后,導出數據進行CT值處理。以U6作為內參,miRNA-208a含量采用2-△△CT法進行計算,[△△CT=△CT實驗組-△CT對照組=(CTmiRNA-208a-CTU6)實驗組-(CTmiRNA-208a-CTU6)對照組]。

圖1 miRNA-208a的核苷酸序列

1.3.4血清NT-proBNP測定:采用電化學發光儀及羅氏診斷有限公司提供的配套試劑盒,嚴格按試劑盒說明書操作,測定血清NT-proBNP水平。

2 結 果

2.1三組基線特征比較:三組性別、年齡、體質量指數、NYHA心功能分級、吸煙、高血壓、高血脂癥、糖尿病、收縮壓、舒張壓、肌酐比較,差異無統計學意義(P>0.05);三組高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、總膽固醇比較,差異有統計學意義(P<0.05);HFrEF組、非HFrEF組低密度脂蛋白、甘油三酯、總膽固醇均明顯高于對照組(P<0.05),高密度脂蛋白均明顯低于對照組(P<0.05);HFrEF組與非HFrEF組高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、總膽固醇比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組基線特征比較

2.2三組心功能指標比較:三組LVEF、LVFS、LAD、LVMI比較,差異有統計學意義(P<0.05);HFrEF組和非HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于對照組,而LAD、LVMI均明顯高于對照組(P<0.05);HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于非HFrEF組,LAD、LVMI均明顯高于非HFrEF組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組心功能指標比較

2.3三組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHCmRNA表達量比較:三組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達量比較,差異有統計學意義(P<0.05);HFrEF組和非HFrEF組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達量均明顯高于對照組,HFrEF組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達量均明顯高于非HFrEF組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組血清NT-proBNP及miRNA-208a β-MHC mRNA表達量比較

2.4miRNA-208a表達量與心功能指標Spearman相關分析:三組miRNA-208a表達量與LVEF、LVFS呈負相關,與LAD、LVMI、NT-proBNP及β-MHC mRNA呈正相關,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 miRNA-208a表達量與心功能指標Spearman相關分析

2.5miRNA-208a對HFrEF的診斷價值:miRNA-208a診斷HFrEF的曲線下面積(AUC)為0.757,最佳截斷值為5.19,約登指數為0.417,敏感度為89.29,特異度為52.42%。血清NT-proBNP、miRNA-208a及β-MHC mRNA三者聯合診斷的AUC為0.996,最佳截斷值為0.592,約登指數為0.956,敏感度為96.43%,特異度為99.19%。見表5、圖2。

表5 miRNA-208a對HFrEF的診斷價值

圖2 NT-proBNP、miRNA-208a及β-MHC mRNA聯合的ROC曲線

3 討 論

根據LVEF可將HF分為HFrEF、LVEF中間狀態的HF、LVEF保留的HF(heart failure with preserved ejection fraction,HFPEF),其中LVEF保留的HF的發病率最高,而HFrEF的死亡率更高,因此,HFrEF的診斷具有重要的臨床意義[6-7]。隨著NT-proBNP水平的升高,心血管事件發生率明顯增高,在HF診斷和治療中NT-proBNP扮演重要角色,NT-proBNP亦是目前診斷HFrEF應用最廣的血清指標,在眾多國家HF指南中給出了明確的診斷臨界值[8]。肌球蛋白是由α-MHC、β-MHC 2條重鏈和4條輕鏈組成的重要的心肌收縮蛋白,α-MHC和β-MHC表達產物有3種二聚體(V1型、V2型、V3型),其中V1型收縮活性最強,V3型最弱。心肌肥厚時,α-MHC的表達水平下降,β-MHC的表達水平上升,表達產物由V1型轉化為V3型,心肌收縮力減弱,而這一過程受多種miRNAs調控。

循環miRNAs是Mitchell P S等[9]于2008年研究發現的,可穩定存在于尿液、羊水、血液(如血清、紅細胞、血漿、血小板)等體液中,且不會被內源性RNA聚合酶降解。血液中含有RNA降解酶,但血液中的miRNAs對其耐受,可穩定存在,同時miRNAs在室溫、凍融、反復煮沸、強堿、強酸條件下仍可保持穩定,為體外試驗奠定有利條件。miRNAs的特征表達模式與病理性心肌肥厚、心力衰竭和心肌梗死密切相關,循環血中存在大量成熟的miRNAs,心肌受損后,因心肌細胞異常而產生的miRNAs被釋放入血,對HF患者檢測相關miRNAs表達水平,有助于實現HF的早期預防和診斷[10]。近來報道,心力衰竭引起的心肌損傷可以引起多種miRNA(miRNA-19a、miRNA-19b、miR-1、miR-208、miR-133等)在血液循環中的表達水平發生變化。JinL[11]的研究發現,心力衰竭小鼠miRNA-19a/19b特異性表達,其與受損心肌的再生和修復密切相關。miR-208是一種編碼在Myh6基因內含子內的miRNA,它調節心臟應激反應。小鼠中miR-208的基因缺失未能誘導一種在基線時的顯性表型,對幾種形式的心臟壓力做出反應,miR-208-null小鼠幾乎沒有心肌細胞肥大或纖維化上調Myh7表達。在成人心臟中,miR-208不僅對Myh7的表達至關重要,而且對與之相關的肌球蛋白亞型Myh7b的表達也至關重要[12]。值得注意的是,這兩個基因都編碼肌球蛋白,并含有內含子miRNA(分別為miR-208b和miR-499),miR-208a、miR-208b和miR-499是由肌球蛋白基因產生的相關miRNA,這些miRNA統稱為MyomiR,miR-208a的基因缺失會降低成年心臟中Myh7b/miR-499的表達[13]。miRNA對心臟功能和功能障礙的重要性表明,在心臟病的背景下,有可能在診斷和治療上利用miRNA的生物學特性[14]。

本研究中比較了HFrEF、非HFrEF患者和對照組的心功能,發現三組LVEF、LVFS、LAD、LVMI存在明顯差異,HFrEF組和非HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于對照組,而LAD、LVMI均明顯高于對照組;HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于非HFrEF組,LAD、LVMI均明顯高于非HFrEF組。三組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達量存在明顯差異,三組miRNA-208a表達量與LVEF、LVFS呈負相關,與LAD、LVMI、NT-proBNP及β-MHC mRNA呈正相關。miRNA-208a診斷HFrEF的曲線下面積(AUC)為0.757,最佳截斷值為5.19,約登指數為0.417,敏感度為89.29,特異度為52.42%。血清NT-proBNP、miRNA-208a及β-MHC mRNA三者聯合診斷的AUC為0.996,最佳截斷值為0.592,約登指數為0.956,敏感度為96.43%,特異度為99.19%。因此,我們認為miRNA-208a可作為診斷HFrEF的生物學標志物,與NT-proBNP、β-MHC mRNA聯合應用診斷效能更佳。