玉米雜交種泛玉398 及其親本指紋圖譜構建

徐運峰，韋勝利

（1. 河南黃泛區地神種業農科院，河南 周口 466632；2. 河南黃泛區地神種業有限公司，河南 周口 466632）

玉米不僅是我國重要的糧食作物［1］，還被廣泛用于工業酒精制造、動物飼料等多種方面，在農業生產中具有舉足輕重的地位。玉米雜交種和親本遺傳真實性是種子質量的重要標志之一，直接影響著玉米生產的產量和質量［2］。近幾年來，糧食安全問題被愈加重視，隨著我國玉米種植面積不斷擴大，除了各省種子管理站的官方審定渠道，各地玉米聯合體和“綠色通道”等審定渠道不斷增加，玉米新品種數量也呈現“井噴式”增長，并且這種情況還在愈演愈烈。而今品種間很難區分［3］，認為是相同或相似品種而被叫停或者終止試驗的現象時有發生，主要原因可能是種質資源有限，已有自交系只是簡單的被集中、反復使用，新選出的自交系同質化嚴重，從而導致一些選配玉米新品系農藝性狀相似，田間表型趨同，DNA 指紋分析位點差異小。品種田間農藝性狀的表現、種子方面的性狀表現等傳統的品種鑒定方法不但費時、費力，而且還易受環境條件影響，已然不能精準鑒定。

簡單序列重復長度多態性（SSR）標記因具有共顯性、多態性高、分型技術簡便快捷、成本低等優點，能夠快速、準確、有效地鑒定玉米雜交種和自交系的真實性，近些年來被廣泛應用在玉米品種標準DNA指紋圖譜構建和檢測中［4-11］。如李麗華等［6］利用9對SSR 核心引物對20 個玉米自交系進行了指紋圖譜構建；高玉倩等［10］采用20 對SSR 核心引物對2005—2009 年吉林省審定玉米品種進行了指紋圖譜構建及分析；周聯東等［11］采用6 對SSR 核心引物對玉米品種沃玉964 進行了指紋圖譜構建及分析。

玉米雜交種泛玉398 是由河南黃泛區地神種業有限公司育成，于2021 年通過河南省審定的抗病、抗倒、高產、適應性廣、年份間田間表現穩定的中晚熟品種，審定編號為豫審玉20210030。本研究基于SSR分子標記技術，利用40 對玉米核心引物對泛玉398 及其親本進行分析，篩選出條帶清晰、親本互補的引物，用來構建泛玉398 及其親本的指紋圖譜，以期為準確、有效地鑒定市場流通的泛玉398 雜交種的真實性提供支持，進而保障該品種的順利推廣。

1 材料和方法

1.1 供試材料與藥品試劑

供試材料為玉米雜交種泛玉398 及其母本A552、父本B13，均由河南黃泛區地神種業有限公司提供。試驗所用CTAB、2×PCR Mix、硝酸銀、丙烯酰胺等藥品購買于上海生工股份有限公司。SSR 分析中所用40 對玉米核心引物由上海生工股份有限公司合成，其序列來自玉米基因組數據庫（http：//www.maizegbd.org/ssr.php）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 玉米品種泛玉398 雜交種及其母本A552、父本B13 種子于28 ℃培養箱中暗培養，于三葉一心期取至少20 棵單株葉片混樣，用CTAB 方法提取其總DNA［12］，加適量TE 緩沖液溶解，剩余樣品放4 ℃冰箱備用。

1.2.2 PCR 擴增及電泳分析 PCR 擴增總體積為15.0 μL，包括2×PCR Mix 7.5 μL、DNA 模板1.0 μL、引物1.0 μL、滅菌水5.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性6 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環；72 ℃終延伸10 min［13］。將1.0 μL 上樣緩沖液加入PCR 擴增產物中并混勻，用移液槍吸取2.5 μL 樣品于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中上樣，電壓150 V 分離檢測擴增產物。凝膠用銀染法顯色，在膠片觀測燈上觀察分析電泳結果。

1.2.3 泛玉398 指紋圖譜構建及其圖譜數字化 根據上述電泳分離結果，篩選出條帶重復性好、清晰，且親本互補的引物，用來構建玉米雜交種泛玉398 及其親本的指紋圖譜。同時，用數字“0”和“1”表示在相同遷移率位置條帶的“無”和“有”2 種情況，將指紋圖譜數字化。并根據公式P=1/2n計算出現相同指紋的概率。

2 結果與分析

2.1 SSR 引物篩選及泛玉398 指紋圖譜構建

利用40 對玉米核心引物對玉米雜交種泛玉398及其親本進行擴增，結果表明，篩選出6 對條帶清晰且親本條帶互補的引物，用來構建泛玉398 及其親本的指紋圖譜（圖1）。這6 對引物分布在玉米的4 條染色體上，分別是bnlg439w1、umc2015k3、umc1705w1、bnlg291k4、umc1147y4、bnlg1671y17，共檢測出24 個等位基因，平均每對引物檢測出4 個等位基因，這些等位基因片段大小在100～500 bp（表1）。這6 對引物所構建的泛玉398 及其親本的指紋圖譜條帶分離良好、清晰穩定、重復性好，可用來鑒定玉米雜交種泛玉398 及其親本的真實性。

表1 用于構建泛玉398 指紋圖譜的引物信息

圖1 篩選出的6 對引物對泛玉398 及其親本的擴增產物

2.2 指紋圖譜數字化

用數字“1”和“0”將以上6 對引物所構建的指紋圖譜數字化，并利用公式P=1/2n計算出出現相同指紋的概率為5.96×10-8（表2），概率極低。表明本研究所構建的雜交種泛玉398 及其親本的指紋圖譜可用來鑒定玉米雜交種泛玉398 的真實性。

表2 雜交種泛玉398 及其親本的數字化指紋

3 結論與討論

玉米是我國重要的糧飼作物，關系到國民經濟的戰略資源。巨大的市場需求量，使得玉米雜交種具有較高的商業化程度，而在利益的驅使下，假劣玉米種子頻現［14］，玉米雜交種的真實性鑒定顯得至關重要。目前，分子標記技術主要用于玉米的遺傳多樣性分析、雜種優勢群劃分、主要性狀的QTL 定位、關聯分析、指紋圖譜構建、種子純度鑒定等方面。SSR技術多態性豐富，呈共顯性，可以區分純合與雜合基因型，對DNA 數量及質量要求低，操作簡單，結果重復性好，是目前玉米種子真實性和純度鑒定中較為常用的技術之一［13］。

本研究利用40 對玉米核心引物對泛玉398 進行SSR 分子標記技術分析，篩選出6 對條帶互補的引物，構建玉米雜交種泛玉398 及其親本的指紋圖譜。同時，為更加直觀地將結果呈現出來，將所構建指紋圖譜數字化，并通過計算，得出出現相同指紋的概率極低，增加了可信程度，說明這6 對引物可用來鑒定雜交種泛玉398 的真實性。生產實踐中，可從中選2～3 對引物用于雜交種泛玉398 的真實性鑒定，操作簡單，不受大田環境影響，結果可靠。本研究為更好地保護玉米新品種泛玉398 及其親本提供了參考依據。