正交試驗優化魚鰾抗氧化肽的提取工藝

郭 鑫，夏子怡，吳 波，夏廣清*，臧 皓*

魚鰾是多數硬骨魚類具有的一種呼吸輔助器官［1］.魚鰾可分為新鮮魚膠和干制魚膠，干制后呈現淡黃色、角質狀［2］，常用于緩解腎虛滑精等癥狀［3］.魚鰾的化學成分包括粘性蛋白、礦物質和維生素等，其中蛋白含量高達79%［4］.目前，魚鰾作為魚類產品生產中的附屬品，其功能性并未得到高度重視，導致魚鰾的利用率較低.

蛋白質和多肽在生物體內發揮著重要作用，可調節生理功能，包括清除體內自由基，調節身體亞健康等多種癥狀［5-6］.董倍余等［7］采用水酶法制備鯽魚多肽，該多肽具有較強清除DPPH 自由基的能力.周勰等［8］采用水酶法制備烏賊纏卵腺多肽，結果顯示該多肽對羥自由基等具有良好的清除能力且呈現劑量依賴性.張麗娜等［9］發現魚籽多肽可通過清除ROS 降低細胞氧化應激水平，進而提高抗氧化能力.多數研究表明，動物類多肽具有較好的抗氧化活性且和相對應的提取工藝有關.因此，本文對魚鰾多肽的提取工藝進行了優化，以期為進一步的活性評價提供理論基礎.海洋類動物的蛋白與多肽大部分具有用藥劑量小、效果好等優點［10-11］，因此具有較廣闊的發展前景.本研究采用水酶法進行提取，參照小球藻多肽的方法［12］，優化了提取魚鰾多肽的工藝.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥魚鰾，通化皇嘉鹿業有限公司；堿性蛋白酶（60 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g），北京索萊寶公司.ReadMax1900Plus 型光吸收酶標儀，上海閃普生物科技公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶解法制備魚鰾多肽工藝

取干燥魚鰾，稱量，剪碎，放入水中浸泡，4 ℃過夜后，溫度60 ℃煮1 h，倒入組織搗碎勻漿機，攪拌30 min，待其變成黏液狀物質后，水浴60 ℃下1 h 進行兩次提取，并合并濾液，冷卻至室溫后進行pH 調節，隨后加入酶酶解（表1），待酶解結束后沸水中滅酶10 min，離心，取上清液置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥50 h，即得魚鰾多肽.

表1 不同蛋白酶最適水解參數

1.2.2 堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽的工藝優化

單因素實驗：考查酶解過程中pH、酶添加量、酶解時間和酶解溫度對ABTS 清除率的影響.固定反應條件中酶添加量10 000 U/g，酶解時間5 h，酶解溫度60 ℃，考察溶液pH（7、8、9、10、11）對ABTS 清除率的影響；固定反應條件pH 9，時間5 h，溫度60 ℃，考察酶添加量（6 000 U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g）對ABTS 清除率的影響；固定反應條件pH 9，酶添加量10 000 U/g，酶解溫度60 ℃，考察酶解時間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）對ABTS 清除率的影響；固定反應條件pH 9，酶添加量10 000 U/g，酶解時間5 h，考察酶解溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）對ABTS清除率的影響.

正交試驗設計：根據堿性蛋白酶最適水解條件及單因素試驗結果，選用正交試驗探究各條件間的交互作用對ABTS 清除率的影響，進而得到魚鰾多肽酶解的最佳工藝（表2）.

2 結果與分析

2.1 各蛋白酶最適條件下的ABTS 清除率

如圖1 所示，不同蛋白酶酶解多肽的ABTS清除率存在一定的差異，但均呈現劑量依賴性，隨著多肽劑量的增加，ABTS 清除率不斷升高.在各個濃度顯示的結果當中，堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率均顯著高于胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解多肽；在濃度為5 mg/mL時，堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率最大，為91.32%±3.21%，胰蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率為80.53%±3.24%，胃蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率最低，為52.63%±1.34%.比較三種不同蛋白酶酶解魚鰾多肽的情況，在后續的實驗中選取具有更高ABTS 清除率的堿性蛋白酶進行魚鰾多肽酶解工藝的優化.

圖1 各蛋白酶最適條件下的ABTS 清除率

2.2 堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽單因素試驗結果

2.2.1 pH 對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS清除率的影響

圖2 顯示，ABTS 清除率隨溶液pH 值的增大而逐漸增加，當pH 值為10 時，達到ABTS 清除率的最大值；但隨著pH 值繼續增大，反而抑制了ABTS 的清除率.因此，在本試驗條件下，適宜的pH 值為10.

圖2 pH 對ABTS 清除率的影響

2.2.2 酶添加量對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響

圖3 顯示，酶添加量小于12 000 U/g 時，ABTS 清除率呈顯著升高趨勢（P<0.05），酶添加量為12 000 U/g 時，ABTS 清除率達到最大值.因此，選擇酶添加量12 000 U/g 時為最佳.

圖3 酶添加量對ABTS 清除率的影響

2.2.3 酶解時間對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響

圖4 顯示，ABTS 清除率在3～6 h 之間顯著提高（P<0.05），魚鰾多肽的ABTS 清除率隨酶解時間的延長不斷增加，6 h 時達到最大值，隨后，ABTS 清除率變化不顯著（P>0.05）.考慮成本等原因，選擇6 h 作為適宜酶解時間.

圖4 酶解時間對ABTS 清除率的影響

2.2.4 酶解溫度對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響

圖5 顯示，溫度在45～60 ℃時，魚鰾多肽ABTS 清除率顯著提高（P<0.05），此時魚鰾多肽ABTS 清除率達到最大值.溫度高于60 ℃后，魚鰾多肽可能有部分發生變性，魚鰾多肽的ABTS 清除率下降.所以選擇適宜酶解溫度為60 ℃.

圖5 酶解溫度對ABTS 清除率的影響

2.3 堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽正交試驗結果

在單因素實驗基礎上，采用正交試驗篩選出最佳工藝參數（表3）.

表3 正交試驗設計及結果

影響堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽工藝的主次因素分別為酶添加量、酶解時間、酶解溫度和pH，最佳提取條件是A1B3C1D1.在此條件下，測得魚鰾多肽為2 mg/mL 時，ABTS 清除率為43.25%±0.95%.

3 結語

本研究以魚鰾多肽的ABTS 清除率作為評價指標進行最優酶的篩選和進一步的工藝優化，采用正交試驗優化魚鰾多肽的提取工藝，得到最優的提取方案，即：提取pH 9、酶添加量10 000 U/g、時間5 h、溫度60 ℃.本試驗確定了魚鰾多肽的最佳提取方案，可為魚鰾多肽的現代應用提供參考，為魚鰾食品藥品的相關方向研究與開發提供依據.