粘細菌代謝產物對乳腺癌細胞抗性的作用

李俊達, 李松原, 張晰, 麻天雨, 劉濤, 劉惠榮*

(1.內蒙古農業大學生命科學學院, 呼和浩特 010018; 2.包頭醫學院內蒙古自治區低氧轉化醫學重點實驗室, 包頭 014060)

粘細菌(Myxobacteria)是一類分布廣泛但分離培養較為困難的革蘭陰性菌,有研究學者認為其是“生活在真核生物邊緣”的高等原核細菌[1]。粘細菌能產生豐富的代謝產物,且這些產物往往有較高的生物抗性[2],如抗菌活性[3]、抗腫瘤[4-5]、抗人類免疫缺陷性病毒(human immunodeficiency virus,HIV)[6]等,此外,粘細菌還在鐵氨氧化循環[7]、生物農藥開發中展現出巨大潛力,這些特性使粘細菌越來越受到藥物開發領域的科研工作者重視,成為重要的藥源微生物。

上述這些優勢條件對粘細菌開發成各類新藥奠定了良好的基礎,也使得粘細菌成為重要的藥源微生物。近年來,隨著人們對粘細菌的更深入了解和開發,研究人員將研究目標轉為粘細菌代謝產物的安全性評價[8]、化合物修飾[9-12]以及粘細菌潛在價值的生物信息學開發[13],但發現新型藥物仍是研究熱點,同時也是化合物加工修飾、生物信息學開發完善的基礎。

近年來,在全球范圍內,乳腺癌的發病率和致死率逐年上升,對人類,尤其對女性的生命健康造成了嚴重威脅。據中國國家癌癥中心統計,2015年乳腺癌發病率居中國女性惡性腫瘤發病的首位,每年新發病例約30.4萬例,致死率高,居全部女性惡性腫瘤的前五位[14]。尋找預防乳腺癌的免疫療法以及患后新型藥物治療成為重中之重,目前,乳腺癌的免疫療法處于新發展階段[15],新型藥物治療仍是患后的良好方案。

1 材料與方法

1.1 細胞株

實驗所用人乳腺癌MCF-7細胞株由內蒙古農業大學生命科學學院萬方教授惠贈。

1.2 主要試劑及儀器

CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NaOH等分析純化學藥品,國藥集團化學試劑有限公司;細胞增殖-毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8),蘭杰柯科技有限公司;生化培養箱,上海一恒科技儀器有限公司;CO2細胞培養箱,美國NuAire;生物安全柜,美國NuAire;酶聯免疫檢測儀,美國伯騰儀器有限公司;熒光倒置相差顯微鏡,日本Nikon;SMZ 745T體式顯微鏡,日本Nikon。

1.3 試驗培養基

菌株的擴大培養和發酵培養分別使用VY/2固體培養基、VY/2液體培養基[16],MCF-7人乳腺癌細胞復蘇、傳代培養使用Gibco公司DMEM液體培養基并加入10%的胎牛血清培養。

1.4 菌株的分離及鑒定

參照廖繼燕等[16]對采集土壤進行處理及粘細菌分離,反復純化直至無雜菌生長,對生長狀態良好的粘細菌菌株通過體式顯微鏡觀察其菌落、子實體的形態,并參照《伯杰細菌鑒定手冊》[17]初步判斷菌株種屬。采用CTAB/NaCl法提取上述粘細菌的DNA[18],對提取得到的DNA進行濃度和純度檢測。其后,使用正向27F和反向1495R的細菌通用引物[19]對其進行16S rDNA序列特異性擴增,電泳檢測后送至北京博邁德公司測序。

1.5 菌株的發酵培養及其代謝產物的提取

采用前期課題組粘細菌發酵優化參數條件[20],即在100 mL的VY/2液體培養基中,加入2 g大孔樹脂,按接菌量10%,在30℃、搖瓶震蕩發酵7 d,收集大孔樹脂,晾干后,加入100 mL甲醇,搖瓶震蕩24 h,收集大孔樹脂甲醇浸提物,經旋蒸、干燥后,使用1 mL甲醇溶解,用0.22 μm濾膜進行過濾除菌,定為原始濃度,即濃度為1.00×,將原始濃度液體稀釋2倍,即濃度為0.50×,將原始濃度液體稀釋4倍,即濃度為0.25×。

1.6 菌株代謝產物的CCK-8細胞毒性檢測

通過CCK-8法檢測粘細菌代謝產物對MCF-7細胞的毒性[21]。收集處于對數生長期的MCF-7細胞接種于96孔培養板上,細胞數量為1×104個/孔,培養體系為100 μL,培養24 h后,分別加入10 μL 0.25×、0.50×、1.00×的菌株代謝產物至96孔板中,在37 ℃、飽和濕度5%CO2條件下進行培養。設置實驗組及對照組如下。

(1)空白實驗組(Ab):培養基。

綜上所述，建立商業銀行客戶滿意度模糊綜合評判模型，可以為我國商業銀行進行客戶滿意度測評提供方法，從而改進客戶關系，從評價中銀行可以了解到客戶對本行所提供產品和服務的滿意程度，也可以通過具體指標的滿意程度來了解客戶的具體需求以改進。本文中的評價方法可以擴展到金融業中使用，應用時，可根據需要對客戶滿意度指標做進一步的細化，同時在確定權值過程中采用多種方法，使主觀與客觀相結合，以求得到更加準確的評估結果。

(2)對照組(Ac):細胞、培養基。

(3)實驗組(As):細胞、培養基、各濃度粗提發酵產物/等體積甲醇。

每組設置3個生物學重復。在培養24、48、72 h時,觀察細胞形態,然后在各孔中分別加入CCK-8溶液10 μL,孵育1 h,并通過使用酶聯免疫檢測儀檢測450 nm波長下樣品的吸光度,計算各處理組抑制率I,公式為

I=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

(1)

式(1)中:I為抑制率;Ac為細胞、培養基和CCK-8的吸光度;As為細胞、培養基、CCK-8和各濃度粗提發酵產物或甲醇的吸光度;Ab為培養基和CCK-8的吸光度。

2 結果與分析

2.1 粘細菌的分離與鑒定

對采集自鄂爾多斯地區的部分土壤樣品進行粘細菌分離,子實體反復純化得到7個菌株。通過肉眼及體式顯微鏡觀察7株菌的菌落和子實體形態(圖1),根據形態特征,對照《伯杰細菌鑒定手冊》中粘細菌形態特征,初步鑒定結果如下。

圖1 代表菌株的菌落、子實體形態Fig.1 Morphology of colonies and fruiting bodies of the myxobacterial strains

(1)E44菌株。子實體為橢球形、粉色、基部有短狀柄結構,具有折光性,不規則點狀分布,且可產生透明粘液,菌落呈現薄膜狀、不規則邊緣,通過比對,該菌株可能為黏球菌科珊瑚球菌屬的珊瑚狀珊瑚球菌(Corallococcuscoralloides)。

(2)E603、E1201、E1202菌株。子實體呈圓形或橢圓形、連續培養潮解,介于黃色到黃綠色,菌落邊緣不規則,但中間菌落形態清楚,有一定的擴散性色素,這些菌株可能為粘球菌科粘球菌屬的變綠粘球菌(Myxococcusvirescens)。

(3)E701、E703、E705菌株。子實體為球形或橢球形、下端收緊、橙色且有柄狀結構,有折光性,呈現出不規則點狀分布,并伴有透明的膜包被,菌落形態呈現出圓形延展,形態飽滿,有半透明的膜,通過比對,這些菌株可能為粘球菌科粘球菌屬的橙色粘球菌(Myxococcusfulvus)。

雖然粘細菌的菌落大小形態及子實體形態作為粘細菌鑒定的重要指標,但由于粘細菌在多次純化轉接中容易發生特征消失,例如子實體變形、退化等現象,故借用分子生物學手段鑒定菌株尤為重要。

提取7株菌株的基因組DNA,使用細菌通用引物擴增菌株的16S rDNA序列并測序,測序后將序列進行BLAST比對,選擇相似度高的序列通過MEGA-7繪制系統進化樹。

如圖2所示,菌株E44與珊瑚狀珊瑚球菌(C.coralloides)模式菌株聚在同一分支;菌株E603、E1201、E1202與粘球菌屬變綠粘球菌(M.virescens)模式菌株聚在同一分支;菌株E701、E703、E705與粘球菌屬橙色粘球菌(M.fulvus)模式菌株聚在同一分支。結合形態學鑒定結果與16S rDNA分子生物鑒定結果相似,表明結果可靠,基本可確定E44屬于珊瑚球菌屬珊瑚狀珊瑚球菌,E603、E1201、E1202屬于粘球菌屬變綠粘球菌,E701、E703、E705屬于粘球菌屬橙色粘球菌。

圖2 基于16S rRNA基因序列的粘細菌菌株系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of myxobacterial strains based on 16S rRNA gene sequence

2.2 菌株代謝產物對MCF-7細胞的影響

制備菌株代謝產物的甲醇抽提物,以不同稀釋度的代謝產物處理MCF-7細胞24、48、72 h后,將96孔板置于顯微鏡下觀察。結果顯示,不同濃度的菌株E44代謝產物在不同處理時間上,均對MCF-7細胞產生影響,與甲醇對照相比,細胞數量明顯減少,細胞形態出現明顯變化,細胞變圓,部分可見細胞碎片,這表明E44菌株代謝產物對MCF-7細胞的增殖可能起到了抑制作用,其他菌株的代謝產物檢測結果類似,均對MCF-7細胞形態、數量產生類似影響(圖3)。

2.3 菌株代謝產物對MCF-7細胞的抑制率

通過CCK-8法檢測菌株代謝產物對MCF-7細胞的抑制率(表1)。7株粘細菌的代謝產物均對人乳腺癌細胞MCF-7產生不同程度的抑制作用。

表1 菌株代謝產物對MCF-7細胞的抑制率Table 1 Inhibition rate of metabolites of the strains on MCF-7 cells

7株菌中,M.fulvusE701代謝產物對細胞的抑制作用最強,0.50×代謝產物處理24 h對細胞的抑制率最高,達106.29%,0.25×代謝產物處理48 h的抑制率最低,為65.27%,所有處理組的細胞抑制率均達到50%以上。M.virescensE1202代謝產物對細胞的抑制作用最弱,其中1.00×代謝產物處理48 h的抑制率在該組中最高,為70.45%,0.50×代謝產物處理24 h的抑制率最低,僅為4.08%,其中僅有3個處理組的抑制率達到50%以上,有6個處理組的抑制率在50%以下。

此外,C.coralloidesE44最佳處理組為0.50×代謝產物處理48 h,抑制率為94.90%,0.25×代謝產物處理72 h的抑制率最低,為48.93%,其中,8個處理組抑制率達到50%以上,1個處理組的抑制率在50%以下;M.virescensE603最佳處理組為1.00×代謝產物處理24 h,抑制率為92.18%,0.25×代謝產物處理72 h的抑制率最低,為46.46%,其中,7個處理組的抑制率達到50%以上,2個處理組的抑制率在50%以下;M.fulvusE703最佳處理組為1.00×代謝產物處理48 h,抑制率為89.98%,0.50×代謝產物處理72 h的抑制率最低,為12.09%,其中,5個處理組的抑制率達到50%以上,4個處理組的抑制率在50%以下;M.fulvusE705最佳處理組為1.00×代謝產物處理48 h,抑制率為86.26%,0.25×代謝產物處理24 h的抑制率最低,為7.45%,其中,5個處理組的抑制率達到50%以上,4個處理組的抑制率在50%以下;M.fulvusE1201最佳處理組為0.50×代謝產物處理72 h,抑制率為93.84%,0.25×代謝產物處理24 h和48 h的抑制率最低,均為10.38%,其中,有3個處理組的抑制率達到50%以上,有6個處理組的抑制率在50%以下。

3 討論

粘細菌代謝產物的抗腫瘤相關研究一直是新藥研究的一大熱點,自從埃博霉素(Epothilones)等[22]一系列粘細菌代謝產生的新型藥物相繼發現以來,粘細菌成為發現新型藥物的重要類群。

Lee等[4]分析研究分離自韓國不同生境的130株粘細菌代謝產物對人乳腺癌MCF-7細胞的影響,其中有33株粘細菌代謝產物對MCF-7細胞有生長抑制作用,分屬于8種不同種屬,包含與本實驗相同的3個種屬,在33株菌株中,M.fulvusKYC4030、M.fulvusKYC4048以及C.coralloidesKYC4081的代謝產物均具有高抗癌活性和低細胞毒性,對MCF-7的抑制率分別為31.0%、72.5%、52.5%,除此之外的其他菌株,由于抗癌活性和細胞毒性相差不大或細胞毒性過強并未進行更為翔實的實驗。其中M.fulvusKYC4048的代謝產物抗腫瘤活性最高且無細胞毒性,通過拮抗Wnt/β-Catenin信號通路進而抑制MCF-7的細胞增殖[23],在本實驗研究中,M.fulvusE701的代謝產物對MCF-7細胞的抑制效果最佳,C.coralloidesE44也對MCF-7有著較好的抑制效果,與上述研究結果類似。

此外,也有相關研究學者探究了粘細菌對其他腫瘤細胞的抑制效果,Kumar等[24]研究分離自印度北部平原的9株粘細菌代謝產物對人肝癌HepG2細胞、人子宮頸癌HeLa細胞、人骨肉瘤MG-63細胞以及人前列腺癌PC-3細胞的抑制效果,結果表明所有粘細菌對上述腫瘤細胞均有抑制作用,同屬于Corallococcussp.S145、Myxococcussp.S199菌株代謝產物對人前列腺癌PC-3細胞的抑制效果最好,抑制率分別為86%、76%。Sharma等[25]研究了分離自喜馬拉雅西北部的10株粘細菌代謝產物對MCF-7細胞、PC-3細胞、人肺癌A549細胞以及人結腸癌HVT-116細胞的抑制效果,同樣,10株粘細菌均對上述4種腫瘤細胞有抑制效果,且存在差異,M.virescens2A對上述4種腫瘤細胞均達到70%以上的抑制率,且對MCF-7細胞、A549細胞、HVT-116細胞抑制率達90%以上,M.fulvusST/P/71在本組實驗中效果最佳,上述4種腫瘤細胞抑制率高達86%以上,除PC-3細胞外,其他細胞抑制率高達96%以上。黃同龍等[26]進行了相關的研究,探討了Myxococcussp.STXZ90代謝產物對多種腫瘤細胞的影響,其中該菌株對人肝癌Hep-3B細胞有著較強的抑制效果,抑制率為90.06%。此外,該課題組還探究了兩株葉柄粘球菌對腫瘤細胞的影響,結果表明葉柄粘球菌CA3對人肝癌SMMC-7721細胞抑制效果明顯,抑制率為50.2%[16],葉柄粘球菌STXZ77對小鼠黑色素瘤細胞B16具有明顯的抑制作用,且細胞毒性較低[27]。這些研究說明,粘細菌的抗腫瘤活性非常顯著,而研究所分離到的粘細菌菌株是否也對這些腫瘤細胞具有拮抗作用,需要今后進一步研究。

Lee等[4]、Sharma等[25]研究均表明同種菌株拮抗效果存在菌株間特異性,在Lee等[4]的研究中,8株M.fulvus對 MCF-7抑制率介于31.0%～72.5%,3株M.virescens對MCF-7抑制率介于48%～83.5%,4株C.coralloides對 MCF-7抑制率介于17%～62.5%;Sharma等[25]研究中,同屬于M.virescens的2A和2B對MCF-7、A549、PC-3、HVT-116細胞的抑制效果差異巨大,如M.virescens2A對HVT-116細胞抑制率為98%,但M.virescens2B對HVT-116細胞抑制率僅為1%,其他3種腫瘤細胞的抑制率也差異較大,且M.virescens2A遠高于同種屬的M.virescens2B,此外,M.fulvusST/P/7與同種屬的其他菌株對上述腫瘤細胞抑制效果存在較大的差異,如M.fulvusST/P/7對MCF-7、HVT-116的抑制率分別為96%、98%,但M.fulvusK/ST/GD/3(2)對這兩種細胞并沒有抑制作用。上述這種現象與研究結果相似,無論是M.fulvusE701、E703、E705還是M.virescensE603、E1201、E1202其抑制率也存在較大的種間差距。

王軍等[28]通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分離M.fulvus15代謝產物得到的5號代謝產物對人肝癌HepG2細胞有著良好的抑制效果,這更加精確了M.fulvus15抑制HepG2細胞的具體物質;鞠培殿[29]通過研究表明,C.coralloides085B04的餾分均對MCF-7均有抑制效果,其中第138號餾分的化合物19效果最好;Sharma等[25]通過分離M.fulvusST/P/71代謝產物得到化合物1,其特征為鄰苯二甲酸二異丁酯(DiBP),對人肺癌A549細胞有良好的抑制作用和商業利用價值。本實驗檢測了7個粘細菌菌株甲醇粗提代謝產物的抗乳腺癌細胞活性,結合前人研究結果表明實驗鑒定的7株菌株均有可能存在對人乳腺癌細胞有抑制作用的代謝產物,今后對代謝產物活性成分的分離及作用機制研究是新藥研發的關鍵一環,相關研究具有重要的意義。

4 結論

粘細菌作為代謝產物新穎、豐富的代表,作為重要的藥源微生物,從中尋找新型、低細胞毒害的代謝產物,是為乳腺癌治療提供新型藥物的有效途徑之一。實驗初步探究了內蒙古鄂爾多斯地區分離到的7株粘細菌代謝產物對人乳腺癌MCF-7細胞的作用,系國內首次報道了變綠粘球菌(Myxococcusvirescens)對人乳腺癌MCF-7細胞的影響,為接下來粘細菌代謝產物對人乳腺癌作用的相關研究奠定基礎。