腎損傷標志物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶檢測方法的研究進展

李志恒, 徐瑞平,2, 王思懿, 肖炳坤, 楊建云, 繆瀟瑤, 黃榮清,2*

(1.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所, 北京 100850; 2. 廣東藥科大學中藥學院, 廣州 511436)

腎臟是人體重要器官,它主要起到維持體液和電解質平衡的作用,可以將部分外源性物質和代謝廢物經尿液排出體外。由于腎臟是藥物代謝的主要場所之一,而藥物毒性是導致器官損傷的重要因素,因此腎臟疾病普遍具有較高的發病率[1-2]。藥物引起的腎損傷包括急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)和慢性腎損傷(chronic renal injury,CKD),AKI以腎功能急劇下降為特點,表現為血肌酐快速升高和尿量減少等癥狀[3-5];CKD表現為腎小球濾過率降低和尿白蛋白排泄增加等[6-8]。腎損傷是一個嚴重的公共健康問題,然而目前對腎損傷的診斷檢測方法如測定血肌酐和尿量等,對于AKI和CKD的早期診斷并不敏感,導致疾病不能得到及時治療,部分CKD向AKI轉化,甚至引起器官衰竭等并發癥導致患者死亡[9]。因此在早期階段及時發現腎損傷并對損傷的發展進行實時監測,對于腎臟疾病的治療具有十分重要的意義[10]。

生物標志物[11]是指可以標記系統、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改變或可能發生的改變的生化指標,具有非常廣泛的用途,可用于疾病診斷、判斷疾病分期或者用來評價新藥的安全性和有效性[12-13]。病理學研究已發現多種腎損傷的生物標志物[14-16],并且某些標志物的表達在病癥早期即可發生顯著變化[17-19],可用于腎損傷的早期檢測。其中,N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)是近端腎小管上皮細胞的溶酶體中發現的最活躍的糖苷酶,它通過催化糖蛋白中的末端葡萄糖殘基進行水解[20]。由于其相對分子質量大于70 kDa,不能通過腎小球滲透正常進入尿液[21-22],因此尿中NAG活力的升高是臨床上腎臟損害的一個重要指標[23-24]。便捷、簡單和精確的NAG活力檢測技術,是目前腎臟疾病研究領域的一個熱門方向。目前NAG活力檢測的方法主要有比色法、毛細管電泳法、熒光探針和電化學法等。

1 比色法和熒光探針法

比色法和熒光探針法作用原理相同,這兩種檢測方法,都是顯色底物與載體連接,載體在與酶結合裂解后釋放出顯色底物,并產生可檢測的顏色或熒光[25-26]。

比色法中常見的顯色底物包括對硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖(P-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamine, pNP-NAG)[27]、2-甲氧基-4-(2′-硝基乙烯基)-苯基2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷[2-methoxy-4-(2′-nitrovinyl)-phenyl-2-acetylamino-2-deoxy-β-D-glucopyranoside, MNP-GlcNAc][28-29]、苯酚偶聯N-乙酰氨基葡萄糖(phenol coupledN-acetylglucosamine,PIP-NAG)[30]等。雖然這些顯色底物在檢測酶活性時得到了廣泛應用,但這些顯色底物極易出現背景干擾如與尿液或血液中的多種成分具有相似的吸收,故而在診斷應用中是有限的。

比色檢測法主要用于實驗室酶聯免疫吸附實驗測定NAG含量。具有成本低廉、操作簡便等優點,但總體而言,大多數顯色底物的檢測限較高,反應速率也比較低,檢測過程中需要較高的底物濃度和較長的孵育時間。目前其發展趨勢是研發長波吸收的易裂解比色底物,以提高檢測的靈敏度和準確率。

基于含熒光素的顯色底物在生命科學中是一種常見的熒光探針,熒光探針法是與顯色底物與酶裂解后釋放強烈的熒光訊號,相較于比色法,熒光探針法的靈敏度[41]、反應速率、亮度、生物相容性都高于傳統的比色法。

張珩[31]巧妙地將比色法中測定吸光度轉化為測定熒光強度,利用水熱法合成了綠色熒光碳點(carbon dots, CDs),其最大激發峰(415 nm)與對硝基苯酚(pNP)重疊,當體系內同時存在CDs和pNP時,由于熒光內濾效應(inner filter effect,IFE)[32]使碳點發光淬滅,在提升靈敏度的同時減少了尿液或血清的背景干擾。其中CDs是一種具有良好生物相容性的納米材料,研究人員還在探索將其用作藥物載體,實現對腎臟疾病的一體化診療[33]。Linko-L?pp?nen等[34]為擴大適用性,以4-MU-GlcNAc為熒光底物,建立了基于熒光探針法的離心式微流控平臺,可自動化完成樣本傳輸、計量、混合和熒光測定等一系列步驟,實現于臨床大批量樣品檢測[35]。為了精準檢測體內NAG含量,Yan等[36]開發了酶激活熒光探針(NHPO)用于順鉑誘導的腎損傷小鼠體內成像和對腎損傷患者的尿液樣本進行檢測(圖1),NHPO在體內具有高靈敏度和高選擇性,適用于復雜生物系統中的NAG檢測,雖然NHPO可以進行活體實時成像,但其在部分熒光通道中沒有響應,因此急需檢測范圍更廣的體內NAG活性檢測熒光探針。Tan等[37]通過將二吡咯亞硼與聚合物基質mPEG-DSPE引入近紅外熒光分子中,制備了水分散納米探針BOD-II-NAG-NP,將NAG熒光探針的發射光譜拓展至第二近紅外窗口區域(the second near-infrared window region,NIR-Ⅱ),為1 000～1 700 nm,相比可見發光的熒光探針具有更好的空間分辨率、更高的信噪比和更深入的組織穿透能力[38-39],獲得了更好的成像效果[40],實時NIR-Ⅱ熒光成像更清晰,產生的背景噪聲更少,BOD-Ⅱ-NAG-NP具有成為臨床監測腎損傷精密傳感器的潛力。熒光探針法的發展前景是檢測多種目標物,可以在同一樣本中進行多種檢測[41-42],降低對于樣本評價的誤差,減少了樣本需要量,提高腎臟損傷早期及時發現和精確診斷。

圖1 熒光探針與NAG作用機理Fig.1 Mechanism of interaction between fluorescence probe and NAG

2 毛細管電泳法

毛細管電泳法是以毛細管作為分離載體、高壓電場作為驅動力,基于樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現混合體系分離的一種分析方法,具有快速、高效和低耗等優點[43]。Friedberg等[44]將尿樣與底物甲基傘形花環-β-D-氨基葡萄糖苷混合后直接進樣檢測,當尿液中存在NAG時,紫外/熒光檢測器可以檢測到反應產物4-甲基傘形酮,在給藥和其他尿液的干擾下,在1.4～23 U/L表現出良好的線性關系。

毛細管電泳法是對比色法和熒光探針法的一種改進,通過增加一個混合體系分離的步驟,減少了背景干擾,進一步提高了檢測的靈敏度[45]。但是底物和待測樣品的極性、緩沖液類型、pH等因素對分離效果有較大影響,在探索分離條件的過程中需要耗費大量精力,且對檢測靈敏度的提高有限,在NAG檢測中應用較少。

3 電化學法

電化學法是建立在物質在溶液中的電化學性質基礎上的一類儀器分析方法,通常將樣品溶液作為化學電池的一個組成部分,并將電池的某種電參數(如電阻、電導、電位、電流、電量或電流-電壓曲線等)與被測物質的濃度建立起聯系,通過電信號數據對待測物質進行定量分析[46]。Pemberton等[47]將底物1-萘基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷修飾到絲網印刷電極(screen-printed carbon electrode,SPCE)上,在NAG催化下底物氧化裂解,電位差發生變化,從而對NAG活力進行定量分析。該電極制備簡單、成本低廉、可批量生產,不需要預處理且一次性使用,可避免交叉污染[48]。Vibulcharoenkitja等[49]基于摻硼金剛石(boron-doped diamond,BDD)圓盤傳感器,使用陽極微分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry, DPV),利用三電極裝置(BDD工作電極、鉑板和用于伏安檢測的Ag/AgCl/3 mol/L KCl參比電極)靈敏監測NAG含量。三電極裝置將產生的游離4NP轉化為可量化的電信號,以便計算尿樣中的NAG活力(圖2)。在傳感器內添加了數值評價,伏安酶分析方法成功使用可批量生產的絲網印刷BBD磁盤傳感器平臺的尿液NAG檢測。

圖2 BDD與NAG作用機理[49]Fig.2 BDD sensing method for detecting NAG in urine of patients with suspected renal damage[49]

電化學法所用的儀器設備體積小、構造簡單、價格低廉[50],可作為便攜式讀數設備進行常規分散臨床測試,有望發展居家便攜式的檢測設備,方便患者及時進行早期診斷,與后續監測。

4 電化學發光法

現代技術中,基于發光的分析要明顯優于比色法和熒光探針法,發光主要的優點在于不需要外部光源的照射,因此其背景干擾低,靈敏度高,對于特定的酶做出反應而發光[51-52]。

電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)是在電極上施加一定的電壓使電極反應產物之間或電極反應產物與溶液中某組分進行化學反應而產生的一種光輻射[53]。自增強電致發光是一種新的提高發光效率的電致發光反應模式,它通過共價連接使發光團及其共反應基團存在于同一分子中[54],具有能夠縮短電子傳輸距離、提高發光穩定性、簡化操作、減少測量誤差等優勢。聯吡啶釕[Ru(bpy)32+,其中bpy表示2,2′-聯吡啶(2,2′-bipyridyl)]由于其在水介質中的高度穩定性、良好的化學性能以及多種共反應物的相容性使其成為研究最多的無機ECL發光體[55]。Wang等[56]以Ru(bpy)32+為發光單元,采用溶劑蒸發誘導自組裝法制備了發光效率較高的納米棒{[Ru(bpy)2(mcbpy)2+-TAPA]NRs}。將功能化的鉑納米顆粒[Ru(bpy)2(mcbpy)2+-TAPA]NRs用于負載檢測抗體(Ab2),并合成了具有層次支化結構的Au/Pd樹枝狀大分子(dnedrimers,DRs),以增加固定化捕獲抗體(Ab1)的量。NAG濃度在0.5～1 pg/mL范圍內線性關系良好,檢測限為0.17 pg/mL。同年該課題組開發了Ru(Ⅱ)絡合物{[Ru(dcbpy)2dppz]2+-DPEA}的光開關分子[57]。以Y形DNA為原料制備了DNA樹狀大分子(第四代,G4),制備的納米復合材料G4-[Ru(dcbpy)2dppz]2+-DPEA與鏈霉親和素標記的檢測抗體結合后發生夾心免疫反應,檢測方法的線性范圍為0.1～1 ng/mL,檢測線降至0.028 pg/mL。

總的來說,電化學發光法方法結合了熒光探針法高靈敏度以及電化學法儀器設備體積小、構造簡單、價格低廉等優勢,在可便攜式讀數的基礎上提供了一種有效的信號放大手段,進一步提高了檢測的靈敏性,為進一步的生物分析和臨床研究提供了巨大的潛力[58]。

5 拉曼光譜法

拉曼光譜(Raman spectroscopy)是一種產生于分子能級或晶格振動能級的光子非彈性散射光譜,其特征峰具有指紋譜特性,位置、強度和線寬可提供分子振動、轉動等信息,據此反映分子中化學鍵和官能團的構成[59-60]。表面增強拉曼散射(surface enhancement of Raman scattering,SERS)則是在常規拉曼光譜法的基礎上,將樣品吸附在膠質金屬顆粒如銀、金或銅表面,或吸附在這些金屬片的粗糙表面上后再進行分析,通過這種預處理,可以使樣品拉曼光譜的強度提高3～6個數量級。理論上講,這種靈敏度完全可以用于生物樣本中酶的定性和定量分析[61],然而盡管將該技術用于酶等生物大分子的檢測分析方法的想法早在20多年前就已經被提出[62-63],但是如何設計能被目標酶高效、快速、有選擇性地切割的底物分子,進而釋放可被基材捕獲并引起SERS反應的報告分子是困擾研究人員的一大難題。Nirala等[64]經過探索,首次設計成功了一種性能優異的底物分子,他們利用多孔硅干涉儀作為SERS平臺,并向其中嵌入銀納米顆粒。底物分子吸附到銀納米顆粒上,產生一個指示性的指紋光譜,強度與底物分子濃度成正比。NAG催化裂解底物產成葡萄糖殘基和1-萘酚,后者立即與重氮染料發生反應,耦合反應產生的不溶性產物與Ag-PSi SERS平臺相互作用,同時放大局部電磁場,使光譜信號發生顯著變化[65](圖3),對尿液和血漿中NAG活力的檢測限分別為0.07 mU/mL和0.50 mU/mL。

圖3 NAG活性相關的SERS信號的機理[62]Fig.3 Mechanism of SERS signals related to NAG activity[62]

拉曼光譜法具有無需樣品預處理、受濃度干擾小、可同時測定多種組分等優點,任何氣態、液態、固態樣品均可直接通過探頭進行檢測并提供無損、快速、簡單、可重復的定性定量分析[66],缺點是容易受到固體粒子、氣泡或渾濁系統中細胞的光散射的干擾[67]。

6 結論

NAG作為腎臟損傷一種重要生物標志物,其檢測技術對于腎臟疾病的診斷治療具有重要意義。自20世紀80年代以來,研究人員通過結構優化以及技術融合的方式,發展了多種NAG活力測試技術,在科研和臨床中發揮了很大作用。對于NAG酶的檢測正在向便攜小型化發展,并在靈敏度、穩定性和成本效益方面進行優化。但是該領域仍有一些難點尚未攻克,未來的研究重點將主要聚焦于以下幾個方面。

(1)提升檢測技術的靈敏度,持續優化底物分子結構,以改進結構設計,開發具有不同信號顯色底物與酶的新組合。擴展特定底物的選擇和更廣泛的標記酶,以實現在單一或多種酶的實時監測至關重要。合理運用空間位阻、吸/給電子官能團、重原子效應,充分考慮分子聚集、內濾效應、共振能量轉移等因素對輸出信號產生的影響,發展包括熒光-比色聯用在內的多技術聯用檢測方法。

(2)拓展檢測技術的線性區間,健康樣本和患者樣本中NAG的活力差值最大可達近2個數量級,現有的檢測技術中,有相當一部分線性區間無法達到這樣的水平。探索構建多通道底物,以及在同一檢測體系中交叉使用多種形式的信號輸出模式(如熒光、比色、光聲和核磁等信號)。

(3)發展診療一體的NAG檢測技術,將腎臟疾病控制在早期階段,提高疾病的治愈率,降低治療成本,拓展NAG檢測技術在臨床的應用。