大熊貓從幼年到亞成體糞便真菌多樣性及功能分析

劉 燕，劉學鋒，胡 昕，郝菲兒，崔多英，劉 赫，滑 榮，盧 巖，鄭常明，楊明海，張成林

（北京動物園管理處，圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京，100044）

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）是我國特有瀕危珍稀物種。根據全國第4 次大熊貓調查結果，野生大熊貓分布在秦嶺、岷山、鄧峽山、大相嶺、小相嶺和涼山6 大山系，共有1 864 只，圈養大熊貓種群數量達到375只［1］。有研究表明，腸道菌群對大熊貓機體健康有重要影響［2-3］，包括參與營養物代謝、能量獲取、免疫系統發育及炎癥性腸病等，同時腸道菌群多樣性也受飲食結構和生活地域的影響［4］。大熊貓本身不能分泌纖維素酶，消化纖維素主要由腸道微生物來完成，腸道微生物的改變可引起消化功能紊亂甚至疾病。與細菌相比，腸道中的真菌所占比例不高，但可影響大熊貓機體疾病的發生及對纖維素的消化利用。由于大量真菌不可培養，通過分離培養方法獲得的真菌在種類、數量和功能上無法反映自然狀態下微生物群落的真實情況，而宏基因組測序技術具有操作簡單、所需樣本量少、檢測快、高通量以及可以檢測出不可培養的微生物的優點，因此可應用到大熊貓腸道真菌的研究中。

針對大熊貓腸道真菌的研究主要集中在成年和老年［5-6］，對幼年向亞成體過渡過程中腸道真菌的研究還鮮見報道。大熊貓從幼年向亞成體過渡階段伴隨著食物的轉換，對成年后的健康影響較大。鑒于此，對北京動物園3 只年齡相仿的大熊貓開展研究，分別于不同月齡采集新鮮糞便，采用高通量測序技術對糞便內真菌多樣性和群落功能進行分析，以期為幼年至亞成體大熊貓的腸道疾病診斷提供基礎理論數據。

1 樣本采集

2013 年8 月出生的3 只大熊貓呼名分別為“萌大”“萌二”和“福祿”，出生后一直飼養于成都，于2014 年10 月轉到北京動物園飼養，其中，“萌大”和“萌二”是一對雙胞胎。分別于14、16、21、26、31、36 月齡采集3 只大熊貓的糞便樣本，每只每次采集3份，即3個重復，共計54份。將“萌大”“萌二”和“福祿”分別編號為D、E 和F。糞便采集時，佩戴一次性無菌手套，使用無菌棉簽從新鮮糞便內部采集10 g左右，立即用液氮保存，回到實驗室放入冰箱-80 ℃保存待檢。

2 試驗方法

2.1 基因組DNA抽提

用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 試劑盒（廣州捷倍斯生物科技有限公司）提取大熊貓糞便中的基因組DNA，具體操作步驟按照說明書進行。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，抽提合格后置于冰箱-20 ℃保存備用。

2.2 18S rRNA基因擴增及測序

以大熊貓基因組DNA 為模板，利用正向引物817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）和反向引物1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）擴增18S rRNA 基因。PCR 擴增反應體系：5×Fast Pfu Buffer 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，Fast Pfu 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，模板DNA10.0 ng，然后補ddH2O至20.0 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共27 個循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。將每只每次采集的3 個重復樣本的PCR 產物混合后，取3 μL 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，并將合格的產物使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收純化PCR產物。

2.3 高通量測序

將擴增產物送上海美吉生物醫藥科技有限公司，利用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量商業化測序。

2.4 數據分析

經MiSeq測序得到的PE reads，根據overlap關系拼接，然后對序列質量過濾和質控。應用Mothur v1.30.1軟件進行Coverage、Simpson和Ace 3種常用指數的測定。基于OTU 聚類分析結果，進行多樣性指數分析和測序深度檢測，并運用統計學t檢驗檢測兩組間的指數值是否具有顯著性差異。應用Usearch v7.0 軟件在相似性97%的條件下，對OTU 代表序列進行聚類分析和物種分類學分析。根據得到的真菌群落豐度數據，利用LEfSe 多級物種差異判別方法進行分析。使用非參數因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和檢驗檢測顯著豐度差異特征，得到與豐度有顯著性差異的類群。通過真菌功能注釋數據庫（http：//www.funguild.org），利用FUNGuild 通過微生態guild對真菌群落進行分類分析。

3 結果

3.1 樣本數據統計

54 份樣本共獲得1 680 845 條有效序列，每個樣本平均含有31 126 條序列，每條序列平均長度為289.4 bp。序列共分屬于23 門、42 綱、76 目、101 科、108屬、170種和2 407個OTU。

3.2 Alpha多樣性分析

3 只大熊貓54 份樣本的覆蓋率（coverage）均達到99.5%以上。根據反應真菌群落多樣性的Simpson 指數可知（圖1A），14～26月齡真菌群落多樣性差異不顯著，而26～36 月齡有所下降。根據反應真菌群落豐富度的Ace 指數可知（圖1B），14～16 月齡真菌群落豐富度有所下降，16～26 月齡逐漸升高，但26～36 月齡又逐漸下降。總體看，26 月齡大熊貓糞便真菌的多樣性和豐富度均達到最高值。3 只大熊貓個體間比較，真菌群落多樣性和群落豐富度均沒有差異（圖2）。

圖1 不同月齡大熊貓間Simpson指數（A）和Ace指數（B）Fig.1 Simpson index（A）and Ace index（B）of giant pandas at different month of age

圖2 大熊貓個體間的Simpson指數（A）和Ace指數（B）Fig.2 Simpson index（A）and Ace index（B）of giant pandas

3.3 Venn圖分析

3 只大熊貓在屬水平上共有和特有的真菌情況見圖3A。3只大熊貓共同擁有66個菌屬，D特有4個菌屬，E 特有19 個菌屬，F 特有8 個菌屬。不同月齡間，共同擁有14 個菌屬，14 月齡特有6 個菌屬，16 月齡無特有菌屬，21月齡特有5個菌屬，26月齡特有4個菌屬，31 月齡特有1 個菌屬，36 月齡特有40 個菌屬（圖3B）。

圖3 大熊貓個體（A）和不同月齡（B）間的真菌Venn圖Fig.3 Venn graph of fungi of three giant pandas individuals（A）and at different month of age（B）

3.4 菌群組成分析

在門水平上，3只大熊貓不同月齡糞便樣本中的真菌菌門主要為子囊菌門（Ascomycota）、unclassified_k__Fungi、unclassified_k__Metazoa__Animalia_、unclassified_d__Eukaryota、擔子菌門（Basidiomycota）和Phragmoplastophyta 等（圖4A）。在目水平上，3 只大熊貓不同月齡糞便樣本中的真菌菌目主要為假球殼目（Pleosporales）、unclassified_p__Ascomycota、unclassified_c__Dothideomycetes 和 煤炱目（Capnodiales）等（圖4B）。

圖4 大熊貓糞便樣本中門（A）和目（B）水平的真菌組成Fig.4 Fecal fungi of giant pandas at the level of phylum（A）and order（B）

3.5 真菌群落差異分析

根據偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），在屬水平上對不同月齡大熊貓糞便樣本真菌進行比較，發現31 月齡的真菌組成與其他月齡開始出現分離，至36月齡均表現出明顯不同（圖5）。在門水平上，36月齡與其他月齡比較，主要差別體現在擔子菌門、Phragmoplastophyta、unclassified_d__Eukaryota、unclassified_k__Metazoa__Animalia_ 和 unclassified_k__Fungi 等（圖6）。36 月齡大熊貓的擔子菌門比例高于其他月齡，而其余菌門的比例低于其他月齡。

圖6 36月齡與其他月齡間門到屬水平的真菌差異Fig.6 Fungi difference analysis at the level of phylum to genus between 36 months of age and the other months of age

3.6 群落功能分析

FUNGuild 功能預測結果表明，從不同月齡大熊貓糞便中得到的真菌從功能上主要屬于未知、植物病原菌（plant pathogen）、未定義腐生菌（undefined saprotroph）和地衣-木質腐生菌（lichenized-wood saprotroph）等10 類。除未知功能的部分，有6 類是通過降解死亡的宿主細胞來獲取營養的腐生營養型，2類是通過損害宿主細胞而獲取營養的病理營養型，沒有通過與宿主細胞交換資源來獲取營養的共生營養型，說明已知真菌主要是通過腐生方式與大熊貓互惠互利。不同月齡間比較，發現36 月齡與其他月齡的差異較大，未知菌占比較少，而未定義腐生菌占24.3%、內生-植物病原菌占20.4%，均高于其他月齡（圖7）。

圖7 不同月齡大熊貓真菌群落功能組成Fig.7 Composition of functional groups of giant pandas at different months of age

4 討論

已有研究表明，子囊菌門是成年和老年大熊貓腸道的優勢菌門，真菌多樣性從高至低依次為成年、老年和亞成體；放歸個體的真菌多樣性和比例有明顯變化，且斷奶前后腸道真菌豐富度會顯著改變，子囊菌門大幅下降，擔子菌門大幅上升［7-11］。在大熊貓成長過程中，最初是以營養豐富的母乳為主食，成年后則以低營養高纖維的竹子為主食，營養代謝和食物代謝的變化具有獨特性，開展從母乳到竹子飲食結構轉變過程的腸道菌群變化研究對其保護具有重要意義。本研究采用高通量測序技術分析了14～36月齡大熊貓從幼年向亞成體過渡的真菌菌群組成和變化規律，反映了糞便中真菌的種類和豐度，研究結果可為亞成體大熊貓腸道微生態健康狀況評估提供基礎數據參考。

本研究中3 只大熊貓因生活史和年齡非常相似，個體間糞便真菌多樣性基本沒有差異，尤其是1 對雙胞胎更為相似。子囊菌門是3 只大熊貓糞便中豐度最高的真菌菌門，這與以往的研究結果［8，12］基本相似。2～5 歲是大熊貓亞成體時期，2 歲時飼料有較大調整。從月齡上看，14～36 月齡是大熊貓從幼年到亞成體的過渡階段，在飼料調整的26 月齡顯現出比較明顯的多樣性變化，真菌多樣性和豐富度在26月齡時都處于峰值。26月齡時飼喂大熊貓的奶粉量略有下降，竹筍、窩頭等飼料量顯著提升，這可能是26 月齡時真菌多樣性和豐富度較高的原因。從真菌組成和群落功能改變來分析，36 月齡與其他月齡間相比變化較大，36 月齡時真菌組成和群落功能發生明顯改變，擔子菌門比例增加，未定義腐生菌和內生-植物病原菌增加，可能是36 月齡時基本不再提供奶粉所致。本研究表明飼料改變和年齡是影響大熊貓腸道真菌組成的重要因素。通過對亞成體大熊貓真菌組成變化的研究，為大熊貓腸道微生態研究提供了重要的基礎數據，為疾病預防、日糧搭配等提供參考依據，以期待可以提高圈養大熊貓的福利。