利舒康膠囊通過Nrf2/HO-1途徑減輕模擬高原缺氧大鼠心肌組織損傷*

田貽婷 孟盼盼 蔡 楠 譚宏強 張朋朋 馬慧萍

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院藥劑科全軍高原醫學實驗室,蘭州 730050)(2.甘肅中醫藥大學藥學院,蘭州 730000)

我國海拔3 000 m以上的高原地區約占國土面積的1/6,主要集中在青海、新疆和西藏地區[1],隨著西部大開發的實施,越來越多的高原從業者和旅游者前往高海拔地區。大氣壓隨著海拔高度的增加而下降,空氣中的氧氣含量也會隨之降低,這種低壓性缺氧會使機體吸入的氧分壓降低,從而大大增加了心肺血管系統的負擔[2]。長期生活在平原或低海拔地區的人們急進高海拔地區時,會引起組織氧合作用的變化和心肺呼吸系統的強制性調節,從而導致心臟負荷過重引起代償性失調,進而導致心臟組織損傷[3]。大量研究表明,除了通過綜合鍛煉習服、階梯習服、模擬低氧習服,以及適當的登高策略等方法外,藥物干預是快速進駐高原時較為現實的預防措施。

利舒康膠囊為國藥準字藥品,課題組前期研究發現其對模擬高原缺氧大鼠具有很好的心臟保護作用,機制可能與清除氧自由基、抗自由基損傷有關,但其具體的作用通路尚未闡明[4]。有文獻[5]報道,核因子E2相關因子2 /血紅素加氧酶1(Nrf2 /HO-1)通路是調節氧化應激的關鍵通路,在高原缺氧損傷中發揮著重要作用。因此,本實驗擬采用大型低壓氧艙模擬高原海拔8 000 m缺氧12 h,進一步探討利舒康膠囊在高原缺氧環境下抗心肌損傷的作用并探究其機制,為利舒康膠囊的深入探究和開發提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級雄性Wiatar大鼠(180～220 g)60只購于聯勤保障部隊940醫院動物科,生產許可證號【SCXK(京)2016-0006】,實驗動物使用許可證號【SYXK(軍)2017-0047】,實驗動物處理遵守聯勤保障部隊第940醫院實驗動物倫理審批,倫理審批號:2021KYLL172。

1.1.2試劑與儀器:Anti-Nrf2抗體、Anti-HO-1抗體、PCNA多克隆抗體(均Abcam公司);β-Actin單克隆抗體(中杉金橋);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);大型低壓氧艙(貴州風雷航空軍械有限公司);紅景天膠囊(西藏軍區紅景天研制中心生產,生產批號:140601);利舒康膠囊(青海益欣有限責任公司,生產批號:20181003);多樣品組織研磨機(上海凈信實業發展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及處理:將大鼠隨機分為正常對照組、缺氧模型組、陽性藥紅景天膠囊組(420 mg/kg)以及不同濃度利舒康膠囊組(280、420、560 mg/kg),每組10只,灌胃給藥,每天一次。正常對照組和缺氧模型組給予等體積的滅菌注射用水,連續給藥7 d。

1.2.2模擬高原低壓低氧實驗:第7天灌胃給藥50 min后,正常對照組大鼠飼養于動物實驗設施,其余各組大鼠放入大型低壓低氧動物實驗艙模擬高原海拔8 000 m缺氧12 h,在艙內自由進食和攝水。結束后將艙內海拔降至3 500 m收集臟器。

1.2.3心肌組織超顯微病理結構觀察:取心肌組織,并立即投入新鮮固定液(2.5%戊二醛)中固定1周后,取出用鋒利刀片切成1 mm的小塊。樣品送往蘭州大學基礎醫學院電鏡室,進行浸透與包埋工作以及電鏡觀察。

1.2.4Western blot法檢測Nrf2和HO-1蛋白表達:將實驗大鼠心臟取出,按照配方分別提取胞核和胞質蛋白,用BCA法測定蛋白濃度并確定蛋白上樣量,加入上樣緩沖液,混勻,沸水煮5 min使蛋白變性。配制10% SDS 聚丙烯酰氨凝膠進行電泳、轉膜和抗體孵育。檢測核轉錄因子E2相關因子-2和血紅素加氧酶-1蛋白表達。次日使用ECL液進行顯影,Image J圖像分析軟件對條帶進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 利舒康膠囊對心肌組織超顯微結構病理影響

對照組心肌細胞肌絲排列整齊,肌節結構清晰,有較完整的線粒體結構,細胞核和線粒體排列整齊,心肌細胞核大,染色質豐富,可見核仁;缺氧模型組肌節結構不清晰,呈“竹節樣”改變,線粒體外膜破壞,明顯腫脹,可見大量空泡化線粒體,心肌損傷嚴重;紅景天膠囊組線粒體腫脹明顯改善,線粒體豐富,可見少數肌絲斷裂,心肌損傷明顯減輕;利舒康低劑量組與缺氧模型組相比無明顯差異,心肌仍存在明顯損傷;利舒康中劑量組與缺氧模型組相比有所改善,但線粒體腫脹明顯;利舒康高劑量組與缺氧模型組相比明顯改善,肌節結構清晰,心肌細胞肌絲完整,線粒體結構完整,少數線粒體腫脹,心肌細胞超微結構基本接近于對照組(圖1)。

圖1 各組大鼠超顯微結構病理變化(×10 000)Fig.1 Ultramicrostructure pathological changes of rats in each group (×10 000)

2.2 利舒康膠囊對心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

與對照組相比,缺氧模型組胞質Nrf2蛋白表達顯著降低(P<0.01),胞核Nrf2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與缺氧模型組相比,紅景天膠囊組胞質Nrf2有上升趨勢,胞核Nrf2有下降趨勢,但無顯著性差異(P>0.05),而利舒康膠囊低、中、高劑量組心肌細胞胞質內的Nrf2蛋白的表達量均有不同程度的上升,且利舒康高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。利舒康膠囊低、中、高劑量組心肌細胞核內的Nrf2蛋白的表達量均有不同程度的下降,且利舒康高劑量具有顯著性差異(P<0.05),見圖2。

注:1.對照組;2.缺氧模型組;3. 紅景天膠囊組(420 mg/kg);4.利舒康膠囊低劑量組(280 mg/kg);5.利舒康膠囊中劑量組(420 mg/kg);6.利舒康膠囊高劑量組(560 mg/kg);與對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與缺氧模型組相比,*P<0.05。Note: 1. Normal control group; 2. Hypoxia model group; 3. Rhodiola capsule group (420 mg/kg); 4. Lishukang capsule low-dose group (280 mg/kg); 5. Lishukang capsule medium-dose group (420 mg/kg); 6. Lishukang capsule high-dose group (560 mg/kg);Compared with control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with hypoxia model group,*P<0.05.圖2 利舒康膠囊對心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Lishukang capsule on the expression of Nrf2 and HO-1 protein in myocardial issue

與對照組相比,缺氧模型組HO-1蛋白表達量顯著升高(P<0.01)。與缺氧模型組相比,紅景天膠囊組HO-1有下降趨勢,但無顯著性差異(P>0.05)。利舒康膠囊低、中、高劑量組均有不同程度的下降,且中、高劑量組具有顯著性差異(P<0.05),見圖2。

3 討論

當機體攝入氧氣不足時,心臟便會啟動代償機制,通過血管擴張、加速心率和加大心臟動力,增加單位時間內的血流量,以此來提高機體的攝氧能力[6]。但同時也會加重心臟的負擔,長此以往會導致心肌細胞氧化損傷,細胞過度凋亡[7]。此外,高原缺氧誘導的氧化應激是導致機體臟器損傷的主要原因,氧化應激是細胞氧化還原平衡被破壞的狀態,即活性氧(ROS)水平超過抗氧化系統的防御能力,而ROS是低壓低氧心肌損傷的主要誘因[8]。本實驗采用大型低壓低氧動物實驗艙模擬高原海拔8 000 m缺氧12 h建立大鼠缺氧模型,通過觀察大鼠缺氧后心肌組織的超微病理結構變化,結果表明,利舒康膠囊可以減輕缺氧大鼠的心肌組織損傷,緩解線粒體腫脹,細胞核和線粒體排列整齊,且利舒康高劑量組優于紅景天膠囊組。

核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)介導的信號傳導是一種主要的內源性細胞防御機制,可抵抗機體氧化應激和神經炎性反應,在氧化應激中發揮重要作用[9]。在機體生理功能正常情況下,Nrf2在細胞中受到Keap1的嚴格調控,二者形成的復合物可被E3泛素連接酶識別,Keap1有效介導Nrf2的多聚泛素化,導致其通過泛素降解系統所降解,呈低活性狀態。在氧化應激條件下,Nrf2和Keap1發生解偶聯,導致蛋白質Keap1/Nrf2復合物的構象變化,此時過量的Nrf2易位至細胞核,從而抑制缺氧引起的心肌細胞凋亡[10-11]。另有研究表明,Nrf2下游基因血紅素加氧酶-1(HO-1)具有保護身體免受氧化損傷,有助于細胞和組織抗炎活性的作用[12]。研究表明,Nrf2/HO-1信號通路的激活可有效防治高原缺氧誘導的氧化應激損傷[13-14]。實驗結果表明,與缺氧模型組相比,陽性藥紅景天膠囊組心肌細胞胞質內Nrf2、HO-1表達明顯減少,胞核內Nrf2表達明顯升高,但無顯著性差異;利舒康低、中、高劑量組心肌細胞胞質內Nrf2、HO-1有不同程度的下降,胞核內Nrf2有不同程度的上升,且高劑量組具有顯著性差異。因此我們推測,利舒康膠囊保護心肌組織免受缺氧損傷的機制可能與調節Nrf2/HO-1途徑相關蛋白的表達有關,在缺氧條件下,經給藥后,促進了Nrf2的活化和入核。使其下游信號分子HO-1表達增加,進而通過清除機體內多余的自由基和ROS來抑制缺氧條件下機體的炎性反應,減輕缺氧引起的心肌損傷。

綜上所述,利舒康膠囊可以減輕缺氧條件下心肌損傷,其機制可能是激活Nrf2/HO-1信號通路,進而清除機體內多余的自由基和ROS積累,從而發揮保護心肌組織的作用。