三種動物胰腺組織單細胞懸液制備效果比較*

牛苗苗 劉 軍 高 偉 曹江北 陳 華

(中國人民解放軍總醫院,北京 100853)

哺乳動物的胰腺是一個由復雜細胞組成的器官,分為外分泌部和內分泌部,其中外分泌部約占95%,主要由導管細胞和腺泡細胞組成,分泌富含消化酶的胰液。內分泌部即胰島,由至少5種內分泌細胞組成:α細胞(分泌胰高血糖素)、β細胞(分泌胰島素)、γ細胞(分泌胰多肽)、δ細胞(分泌生長抑素)、ε細胞(分泌饑餓素)[1]。其中胰島β細胞是體內唯一可以分泌降糖激素胰島素的細胞,對于調控機體血糖穩態具有至關重要的作用。因此,胰腺是哺乳動物維持生命健康必不可少的重要器官之一[2]。并且,不同動物胰腺組織形態結構和細胞分布存在一定的差異[3-4]。

單細胞測序技術應用單細胞解離和新一代基因測序技術,能夠對細胞群體中每一個細胞的基因組、轉錄組及表觀基因組進行高分辨率檢測,獲得單個細胞的遺傳信息[5]。其中,制備高活性、高質量的單細胞懸液對于后續測序開展和數據分析至關重要。2016年,研究人員應用單細胞測序技術,首次在單個細胞水平上獲得了人胰島細胞的遺傳信息[6]。然而,對于不同種屬動物的胰腺組織單細胞遺傳信息分析,目前報道較少。本研究選取巴馬小型豬、SD大鼠、C57BL/6小鼠三種動物的新鮮胰腺組織,制備了單細胞懸液,并對單細胞解離效果進行了比較,以期為后續單細胞測序的開展奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:7～8月齡普通級雄性去勢巴馬小型豬1頭,體質量24 kg,購自北京實創生物科技技術有限公司,生產許可證號【SCXK(京)2018-0011】,使用許可證號【SYXK(軍)2017-0017】。8周齡雄性SPF級SD大鼠1只,體質量316 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠1只,體質量22.1 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,生產許可證號【SCXK(京)2019-0010】,使用許可證號【SYXK(軍)2017-0019】。本實驗通過解放軍總醫院實驗動物福利倫理委員會的審查,倫理審批號:2021-x17-131,實施過程中嚴格遵守其指導原則。

1.1.2試劑與儀器RPMI:1640培養基(Invitrogen生命技術有限公司, 貨號11875119)。細胞篩(美天旎生物技術有限公司,貨號130-098-462)。紅細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司,貨號R1010)。吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)雙染試劑(上海睿鈺生物科技有限公司,貨號RE010212)。全自動細胞熒光分析儀(上海睿鈺生物科技有限公司,型號Countstar Rigel S2)。

1.2 方法

1.2.1胰腺組織取材及解離:分別取巴馬小型豬、SD大鼠、C57BL/6小鼠的新鮮胰腺組織,約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm一塊,在RPMI 1640培養基中洗滌后剪碎。置于5 mL單細胞解離液中,37 ℃消化30 min。解離后使用70 μm細胞篩過濾,然后4 ℃, 1 200 r/min離心5 min,收集細胞沉淀。

1.2.2去除紅細胞:按1∶3的比例向細胞沉淀中加入4 ℃預冷的紅細胞裂解液,輕輕吹打混勻,靜置裂解2～5 min后,1 200 r/min離心5 min,棄去上層紅色清液,以去除紅細胞。收集細胞沉淀,加入4 ℃預冷的RPMI 1640培養基,4 ℃ 1 200 r/min離心5 min,離心洗2～3次。

1.2.3AO/PI染色及細胞分析:應用AO/PI雙染試劑分別對細胞核酸進行熒光標記,使用全自動細胞熒光分析儀隨機選取3個視野,檢測單細胞解離后的細胞數量和活力,具體指標包括:細胞活率、總細胞濃度、活細胞濃度、細胞的平均直徑和平均圓度、細胞結團率。每個樣品分別進行3次分析,并對三種動物胰腺組織單細胞解離效率進行比較。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 三種動物胰腺組織單細胞懸液細胞形態比較

鏡檢觀察可發現,巴馬小型豬、SD大鼠、C57BL/6小鼠胰腺組織單細胞懸液細胞形態完整、邊界清楚、有少量結團,雜質及細胞碎片少(圖1)。數據統計顯示,SD大鼠細胞結團率最高(31.50%±1.00%),巴馬小型豬次之(28.69%±0.34%),C57BL/6小鼠最低(20.80%±0.32%),三者相比均有統計學差異(圖2A)。SD大鼠胰腺細胞的平均直徑最大(13.59±0.07)μm,C57BL/6小鼠次之(12.56±0.06)μm,巴馬小型豬最小(12.52±0.10)μm。SD大鼠與巴馬小型豬、C57BL/6小鼠之間均有統計學差異(P<0.01),巴馬小型豬與C57BL/6小鼠之間沒有統計學差異(圖2B)。平均圓度上,C57BL/6小鼠圓度最大(0.76±0.03),巴馬小型豬次之(0.69±0.05),SD大鼠最小(0.62±0.01)。僅C57BL/6小鼠與SD大鼠之間有統計學差異(P<0.05),其他均無(圖2C)。

注:A.巴馬小型豬;B. SD大鼠;C. C57BL/6小鼠。Note:A. Bama miniature pig; B. SD rat; C.C57BL/6 mice.圖1 三種動物胰腺組織單細胞懸液鏡檢(×10)Fig.1 Microscopy images of single cell suspension of pancreatic tissue from three different animals (×10)

注:A.細胞結團率;B.平均直徑;C.平均圓度。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:A. cell aggregation rate; B. average diameter; C. average roundness.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.圖2 三種動物胰腺組織單細胞懸液細胞形態比較Fig.2 Comparison of cell morphology in single cell suspension of pancreatic tissue from three different animals

2.2 三種動物胰腺組織單細胞解離效果比較

AO/PI染色及全自動細胞熒光分析儀結果顯示(圖3),巴馬小型豬(圖3A)、SD大鼠(圖3B)、C57BL/6小鼠(圖3C)三種動物新鮮胰腺組織經細胞解離獲得的單細胞懸液,隨機視野下均以AO標記的活細胞綠色熒光為主,有少量PI標記的死細胞紅色熒光,同時存在個別細胞結團現象。

注:A. 巴馬小型豬;B. SD大鼠;C. C57BL/6小鼠。Note:A. Bama miniature pig; B. SD rats; C. C57BL/6 mice.圖3 三種動物胰腺組織單細胞懸液AO/PI染色圖片(×10)Fig.3 AO/PI staining images of pancreatic tissue single cell suspension from three different animals (×10)

數據統計顯示(圖4),SD大鼠細胞活率最高(93.52%±1.00%),巴馬小型豬次之(92.91%±0.84%),C57BL/6小鼠細胞活率最低(87.42%±1.13%)。C57BL/6小鼠與巴馬小型豬、C57BL/6小鼠之間均有統計學差異(P<0.05),巴馬小型豬與SD大鼠相比沒有統計學差異(圖4A)。總細胞濃度上,巴馬小型豬濃度最高(平均值1.29×106個/mL),SD大鼠次之(平均值1.08×106個/mL),C57BL/6小鼠最低(平均值1.03×106個/mL)。巴馬小型豬與SD大鼠之間、SD大鼠與C57BL/6小鼠之間均沒有統計學差異,但巴馬小型豬較C57BL/6小鼠高,具有統計學差異(P<0.05,圖4B)。活細胞濃度上,巴馬小型豬濃度最高(平均值1.20×106個/mL),SD大鼠次之(平均值1.02×106個/mL),C57BL/6小鼠最低(平均值0.89×106個/mL)。巴馬小型豬與SD大鼠(P<0.05)、C57BL/6小鼠(P<0.01)之間均有統計學差異,SD大鼠與C57BL/6小鼠之間沒有統計學差異(圖4C)。

注:A. 細胞活率;B. 總細胞濃度;C. 活細胞濃度;*P<0.05,**P<0.01。Note:A. cell viability, B. total cell concentration,C. live cell concentration.*P<0.05,**P<0.01.圖4 三種動物胰腺組織單細胞懸液細胞計數結果Fig.4 Cell count results of single cell suspension of pancreatic tissue from three different animals

3 討論

單細胞測序技術是近年興起且發展迅速的一項檢測技術,廣泛應用于細胞異質性、免疫微環境、胚胎發育和細胞分化、腫瘤發生機制等領域的研究[7-11]。組織單細胞懸液的制備是單細胞測序的關鍵環節和重要基礎。物種來源、組織類型、樣本年限、處理方法、保存環境等多種因素,都會影響組織單細胞懸液制備的效率和活性[12-15]。

胰腺是一個由復雜細胞組成的器官,由導管細胞、腺泡細胞和至少5種內分泌細胞構成。采用傳統測序技術很難準確獲得胰腺各類型細胞的遺傳信息。應用單細胞測序技術,可以從細胞圖譜的角度,對胰腺組織中每一個細胞的基因組、轉錄組及表觀基因組進行高分辨率檢測,獲得單個細胞的特異性遺傳信息,并探索不同類型細胞間的互作方式,是研究胰腺組織異質性的良好工具。與其他組織相比,胰腺外分泌部會分泌大量消化酶,損傷胰腺中其他類型細胞,造成其單細胞懸液制備較一般組織更為困難。

本研究成功制備了巴馬小型豬、SD大鼠、C57BL/6小鼠三種常用實驗動物的新鮮胰腺組織單細胞懸液,為后續單細胞測序工作的開展奠定了基礎。實驗結果顯示,三種動物胰腺組織單細胞懸液細胞形態完整、邊界清楚。巴馬小型豬和SD大鼠細胞活率均在92%以上,C57BL/6小鼠細胞活率相對較低,這可能與C57BL/6小鼠胰腺組織較小且細胞直徑小,易受損傷相關,后期需進一步優化解離條件,提高其細胞活率。巴馬小型豬總細胞濃度和活細胞濃度最高,這一結果證明,巴馬小型豬胰腺組織細胞豐富,解離條件良好,但存在少量細胞結團的問題,需進一步優化條件。SD大鼠胰腺細胞平均直徑較巴馬小型豬和C57BL/6小鼠大,這與前期胰腺組織病理圖片觀察到的結果一致,證明不同物種的胰腺細胞形態也存在一定的差異。本研究也有一定的局限性,如動物數量較少,后期在本研究基礎上進一步擴大動物數量、優化實驗條件,探索更加高效的制備胰腺組織單細胞懸液的方案。