D-半乳糖誘導青年樹鼩卵巢衰老*

田川葉麗趙曉娟朱向情趙晶阮光萍潘興華

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第920醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室,云南省細胞治療技術轉化醫(yī)學重點實驗室,干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合工程實驗室,昆明 650032)

卵巢作為衰老最敏感的器官之一,可隨年齡增長而自然衰老,也可因疾病、感染、中毒等導致卵巢衰老,引起女性內分泌紊亂和全身組織器官結構退變以及功能衰退,導致女性不孕,并使卵巢衰老相關疾病高發(fā)[1]。卵巢衰老是一個長期而復雜的過程,其與神經、內分泌、免疫、氧化應激、遺傳易感、線粒體受損等因素有關,然而,目前多因素導致卵巢衰老的分子機制并不完全清楚[2]。可見,一個合適的模式生物將有助于研究人員探索卵巢功能下降的危險因素和闡明其分子機制,并有助于預防或延緩卵巢衰老過程[3]。而樹鼩的遺傳、解剖、生理、神經、免疫等與人類相對接近,比現(xiàn)有的中小型實驗動物更接近于人類,比獼猴等靈長類實驗動物成本低,用于實驗研究的結果對人類有較大參考價值[4-5]。此外,樹鼩的體質量、體積均與大、小鼠相接近,實驗操作方便,易于大規(guī)模實驗研究[6]。因此,樹鼩卵巢衰老模型是研究卵巢衰老的理想模型。

D-半乳糖(D-galactose,D-gal)作為一種還原糖,可通過半乳糖激酶和半乳糖1磷酸尿苷轉移酶分解為葡萄糖代謝,使活性氧過度累積,破壞基因組的穩(wěn)定性,引起氧化應激損傷,導致機體代謝紊亂、抗氧化應激系統(tǒng)失衡[7]。此外,D-gal可與蛋白質、氨基酸等游離基團發(fā)生反應,形成晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGE),AGE通過與晚期糖基化終產物受體和其他受體結合,在卵巢顆粒、葉黃素和單核細胞等表面積聚,促進炎性反應,加速卵巢衰老。因此,D-gal被廣泛用于抗衰老藥物開發(fā)的動物模型研究。基于以上研究結果,本研究以樹鼩來作為卵巢衰老的研究對象,利用D-gal誘導法,通過觀測卵巢組織結構、增殖活性、細胞凋亡和衰老相關標志分子等指標,評價、建立卵巢衰老模型,可為卵巢衰老的研究提供技術參考方案。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級雌性青年樹鼩(n=8)購買自中國科學院昆明動物研究所,實驗動物生產許可證號【SCXK(滇)K2017-0003】,平均年齡3.5歲,體質量130～160 g,飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第920醫(yī)院動物實驗室,其環(huán)境清潔、衛(wèi)生,達到動物飼養(yǎng)環(huán)境標準,實驗動物使用許可證號【SYXK(軍)2017-0051】,實驗動物倫理審批號為:倫審2021-055(科)-01。

1.1.2主要實驗試劑與器材:通用型中性組織固定液、HE染液(Servicebio)、Masson 染液(均Servicebio);Tunel 試劑盒(Vazyme);無水乙醇(天津市風船化學試劑科技有限公司);中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司);IX70-121倒置相差顯微鏡(Olympus);冰凍切片機(Thermo);D-gal(Sigme, G0750-50G)。

1.2 方法

1.2.1D-gal溶液配制及頸背部皮下給藥:電子天平稱取適量的D-gal粉末,倒入500 mL燒杯中加入無菌注射用水,用磁力攪拌器攪拌至透明,并配制成30%的D-gal溶液,于50 mL無菌離心管中備用。8只青年樹鼩經1周適應性飼養(yǎng)、觀察無異樣后,隨機分為對照組(n=4)與模型組(n=4),D-gal溶液按2.5 mL/g的劑量,給予模型組樹鼩頸背部皮下注射,每天1次,連續(xù)給藥5個月。

1.2.2HE染色:石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min,加雙蒸水沖洗3次。蘇木精染液染4 min,雙蒸水沖洗3次,分化液處理5 min,加雙蒸水沖洗3次,返藍液處理5 min,加雙蒸水沖洗3次。切片依次放入85%和95%乙醇脫水5 min,伊紅染液處理5 min。切片依次放入無水乙醇I 5 min、無水乙醇II 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min透明。中性樹膠封片。熒光倒置顯微鏡下觀測、拍照。

1.2.3Ki67染色:切片依次放入環(huán)保型脫蠟液Ⅰ10 min、環(huán)保型脫蠟液Ⅱ10 min、環(huán)保型脫蠟液Ⅲ 10 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、ddH2O2沖洗。抗原修復,PBS(PH7.4)洗滌3次,每次5 min。組織周圍畫圈,加血清封閉30 min。加一抗(Ki67,1∶200),濕盒內4℃孵育過夜。PBS洗滌3次,每次5 min。加對應的二抗(CY3山羊抗兔,1∶200),避光室溫孵育50 min。PBS洗滌3次,每次5 min,加DAPI染液,避光室溫孵育10 min。PBS洗滌3次,每次5 min,加自發(fā)熒光淬滅劑B液5 min,ddH2O2沖洗10 min。加抗熒光淬滅封片劑封片。采集圖像。

1.2.4Tunel染色:切片37 ℃烘箱烘烤15 min,4%多聚甲醛固定 30 min,PBS(pH 7.4)洗滌 3 次,每次5 min。組織周圍畫圈并加蛋白酶K工作液,37 ℃溫箱孵育25 min。PBS洗滌 3 次,每次5 min。加破膜液室溫孵育20 min,PBS洗滌3次,每次5 min。加1×平衡緩沖液室溫孵育 10 min。加重組末端脫氧核糖核苷酸轉移酶、BrightRed Labeling Mix、5×平衡緩沖液和ddH2O2的混合液,37 ℃孵育2 h。PBS洗滌 3 次,每次5 min。加 DAPI 染液室溫避光孵育10 min。PBS洗滌 3 次,每次5 min。加抗熒光淬滅封片劑進行封片。熒光倒置顯微鏡下觀測、拍照。

1.2.5免疫組織化學染色 :切片依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min后,雙蒸水沖洗3次。EDTA抗原修復液處理5 min,中火8 min、停火8 min、低火7 min。PBS洗滌3次,每次5 min。組織周圍滴加BSA孵育30 min,加一抗(P53/21/16)4 ℃過夜,PBS洗滌3次后,每次5 min。二抗孵育60 min。抗熒光淬滅封片劑封片。DAPI染液孵育10 min。PBS洗滌3次,每次5 min,再用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 卵巢組織結構變化

對照組樹鼩卵巢組織細胞排列整齊,間質和髓質界限明顯,可見原始卵泡(黑色箭頭)、初級卵泡(藍色箭頭)、次級卵泡(橙、綠色箭頭)、成熟卵泡(紫色箭頭),并有可見少量閉鎖卵泡(深藍色箭頭)。模型組樹鼩卵巢組織細胞排列散亂,間質和髓質界限模糊,局部只見原始卵泡(黑色箭頭)、初級卵泡(藍色箭頭)、次級卵泡(橙色箭頭)且其數量顯著低于對照組樹鼩,還可見大量閉鎖卵泡(深藍色箭頭)(圖1)。

注:黑色箭頭:原始卵泡;藍色箭頭:初級卵泡;橙、綠色箭頭:次級卵泡;紫色箭頭:成熟卵泡;深藍色箭頭:閉鎖卵泡。Note:Black arrow:primitive follicles;blue arrow:primary follicles;Orange,green arrow:secondary follicles; purple arrow:mature follicles;dark blue arrow: atretic follicles.圖1 卵巢組織HE染色Fig.1 HE staining of ovarian tissue

2.2 P53、P21、P16蛋白表達

P53、P21、P16標記的細胞,藍色為細胞核。結果顯示,模型組可見大量P53、P21、P16標記的棕褐色細胞,而對照組局部只見少量棕褐色細胞。統(tǒng)計學分析結果顯示,模型組P53、P21、P16標記的陽性細胞率顯著高于對照組,表明模型組卵巢組織中P53、P21、P16的蛋白表達水平均顯著高于對照組(圖2)。

*P<0.01,**P<0.001圖2 卵巢組織免疫組織化學染色Fig.2 Immunohistochemical staining of ovarian

2.3 細胞分裂增殖

Ki67標記的細胞,藍色為細胞核被。Ki67染色結果顯示,對照組成熟卵泡中可見大量紅色熒光,而模型組局部只見少量紅色熒光,統(tǒng)計學分析結果表明,對照組Ki67標記的陽性細胞率顯著高于模型組(圖3)。

*P<0.001圖3 卵巢組織Ki67染色Fig.3 Ki67 staining of ovarian

2.4 細胞凋亡

紅色為凋亡的細胞,藍色為細胞核。結果顯示,對照組樹鼩卵巢局部只見少量紅色熒光,而經D-gal背頸部注射5個月后可見有大量紅色熒光出現(xiàn),表明對照組樹鼩卵巢僅有少量細胞凋亡,模型組樹鼩卵巢有大量細胞凋亡(圖4)。

*P<0.01圖4 卵巢組織Tunel染色Fig.4 Tunel staining of ovarian

3 討論

目前,多種因素導致卵巢衰老的女性人群不斷增多,而針對卵巢衰老的治療方法多是延緩疾病發(fā)展,并不能從根本上解決卵巢衰老誘發(fā)的內分泌紊亂、多組織器官結構衰退和不孕等問題,且會伴隨相關并發(fā)癥的發(fā)生,如激素替代治療會引起乳腺癌、血栓和卵巢癌等病發(fā),究其原因部分是因為引起卵巢衰老關鍵的細胞和分子調控機制尚不明確。獲得與人類更為接近的卵巢衰老模型是解析卵巢衰老發(fā)生發(fā)展的關鍵要素之一。因此,樹鼩屬于非人類靈長類動物,其遺傳和生理生化等與人類相近,通過D-gal誘導法建立樹鼩卵巢衰老模型,獲得的研究結果將對女性卵巢衰老治療具有更重要的參考價值。

卵巢衰老被認為是以卵泡數量逐漸減少為主導的,這與卵母細胞的質量下降相一致[8]。卵巢衰老的典型特征是組織結構破壞、卵母細胞數量減少且質量降低、卵泡閉鎖。衰老作為一個漸進的、不可逆轉的病理生理過程,表現(xiàn)為組織和細胞功能下降,各種與衰老相關的疾病風險顯著增加[9]。本研究的HE結果顯示,青年健康雌性樹鼩經D-gal溶液行頸背部注射5個月后,卵巢組織細胞排列散亂,局部只見少量原始卵泡和初級卵泡,并有大量閉鎖卵泡。在小鼠模型上,通過連續(xù)皮下注射D-gal約6周已被證明可以加速大腦、腎、肝衰老,降低血漿中抗苗勒氏激素(AMH),誘導卵巢衰老[10]。這和本研究的實驗結果相一致,提示D-gal溶液經頸背部給藥可使青年樹鼩卵巢組織結構破壞、卵泡閉鎖。

激活P53-P21-和P16依賴的DNA損傷反應可減弱細胞的增殖能力,加速細胞衰老。研究表明,腫瘤蛋白P53可通過調節(jié)細胞周期停滯和細胞凋亡來決定DNA損傷檢查點反應的結果,故在DNA損傷反應中起核心作用,包括對細胞衰老、基因組不穩(wěn)定、線粒體功能障礙和代謝途徑改變等調控方面扮演重要角色[11]。P21作為細胞周期進程的關鍵負調控因子,它可以與細胞周期蛋白依賴性激酶和特定的細胞周期蛋白形成復合物,在特定階段誘導細胞周期阻滯,穩(wěn)定P21蛋白表達,可導致細胞周期阻滯在G1期[12]。僅P21就足以驅動細胞衰老程序,包括轉錄組改變、DNA損傷、線粒體功能障礙和衰老相關的分泌表型[13]。P16細胞周期調節(jié)因子是最經典的衰老生物標志物之一,因為它在胚胎發(fā)育早期被抑制,在衰老過程中逐漸被激活,在細胞衰老和干細胞動力學等導致衰老的關鍵細胞命運決定中起著至關重要的作用[14]。P16抑癌基因在衰老組織中積聚,是細胞衰老的生物標志物,其在體內限制干細胞的功能[15]。本實驗中,與對照組相比較,模型組卵巢組織中P53、P21、P16的蛋白表達水平均顯著升高,提示了青年雌性健康樹鼩經D-gal溶液行背頸部給藥5個月,可誘導卵巢組織細胞衰老。

Ki67是細胞周期進程和進入靜止狀態(tài)以來的時間的分級標記,作為一種和細胞周期相關的蛋白質,可間接反映細胞增殖活性[16],Ki67染色在臨床上被廣泛用作增殖指標。因此,我們利用Ki67染色來觀測經D-gal干預后細胞的增殖活性,結果顯示,對照組細胞增殖活性顯著高于模型組。有研究在單細胞水平觀測內源性調控下Ki67水平隨時間的變化,發(fā)現(xiàn)Ki67的積聚只發(fā)生在S、G2和M期[16]。

卵母細胞凋亡導致卵巢功能不全[17],顆粒細胞凋亡會導致卵泡閉鎖[18]。卵巢卵泡池的大小受細胞凋亡和自噬的調節(jié),前者是導致生理性下降的原因,后者在青春期前的生理性卵泡池縮小中起主要作用[19]。也有研究表明,衰老的卵泡間質細胞產生的與衰老相關的分泌表型相關的細胞分泌趨化因子配體,可能通過促進顆粒細胞凋亡而在卵巢衰老過程中損害卵泡的發(fā)育和成熟[20]。而本實驗結果顯示,青年健康樹鼩經D-gal溶液行頸背部注射給藥5個月后,TUNAL染色結果顯示卵巢組織細胞凋亡率明顯增加,且模型組樹鼩卵巢組織可見大量的閉鎖卵泡。有研究發(fā)現(xiàn)[21],在D-半乳糖誘導小鼠衰老的轉錄與代謝譜研究中,D-半乳糖對衰老的影響可能與糖和脂代謝紊亂、氧化損傷、晚期糖基化終末產物的積累和細胞凋亡顯著相關[21]。這些研究結果提示了D-gal可誘導卵巢衰老,而這可能是由于卵巢細胞凋亡增加所導致的。

綜上所述,可見D-半乳糖按8 g/kg的劑量給予青年樹鼩頸背部皮下注射給藥5個月,可使卵巢組織結構散亂,衰老標志分子P53、P21、P16蛋白表達上調,使細胞分裂增殖能力減弱,細胞凋亡率增加,從而誘導卵巢衰老。