白花丹素對金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果

劉碧涵，王 峰，張陸成，袁建輝，*

1.廣西醫科大學生命科學研究院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學基礎醫學院生理學教研室，廣西 南寧 530021

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，MSSA）是一種常見的革蘭陽性致病菌，其可感染人體的胃腸道、皮膚和鼻腔等部位，引發皮膚感染和心內膜炎等疾病[1]。隨著抗生素的廣泛使用，一些MSSA 對常用的甲氧西林類藥物產生了耐藥性，這類細菌被稱為“耐甲氧西林金黃色葡萄球”（Methicili-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）[2]，該菌也是引起體內感染的重要病原菌之一。相較于MSSA，MRSA 能夠分泌多種毒力因子，更難被普通藥物殺滅，會嚴重危及患者的生命安全[3]。白花丹素（plumbagin）是從傳統中草藥白花丹中提取的一種羥基萘醌類化合物[4]，其在抗癌、抗菌、抗炎等方面表現出了很強的生物活性[5]。近期的研究發現，白花丹素對多種細菌都具有抑制作用，對細菌的生長、聚集、代謝等都產生了影響。本文基于此研究白花丹素對MRSA 和MSSA 的抑菌效果，有助于發現新的抗菌作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗材料：金黃色葡萄球菌（ATCC 25293，MSSA）與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC 43300，MRSA），菌株由廣西醫科大學微生物教研室贈予，保存在-80 ℃的冰箱中，復蘇使用；TSB 培養基，TSA 瓊脂培養基，0.1%結晶紫水溶液（北京Solarbio）。

實驗儀器：恒溫培養搖床（上海一恒THZ100），超純水機（YYTIII-20L），超低溫冰箱（海爾DW-86L578J），培養箱（ZXDP-A2160），醫用冷藏冰凍冰箱（海爾HYCD-282），生物安全柜（海爾HR40-IIA2），TriStar2 LB942 多功能酶標儀（德國Berthold）。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定白花丹素對MSSA 和MRSA 的MIC

將MSSA 和MRSA 復蘇后，在TSB 培養基中傳代三次；在96 孔板中對白花丹素進行梯度稀釋，使藥物質量濃度依次為512、256、128、64、32、16、8、4、2、0 μg/mL，加入對應的細菌懸液，使細菌濃度達到1×105CFU/mL，以無菌TSB 肉湯為陰性對照；37 ℃恒溫震蕩搖床過夜培養，次日觀察孔內的渾濁程度，肉眼澄清即為最低抑菌濃度（Minimal Inhibit Concentration，MIC）。重復三次實驗。

1.2.2 測定白花丹素對MSSA 和MRSA 的MBC

在進行1.2.1 的實驗后，選擇96 孔板中未產生渾濁的澄清孔，每孔取10 μL 涂布在TSA 平板上，于37 ℃恒溫培養箱中靜置培養24 h。平板上無細菌生長即為最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。重復三次實驗。

1.2.3 建立MRSA 和MSSA 的生物被膜體外模型

MRSA 和MSSA 分別傳代三次后，用培養基將菌液稀釋，調整OD600為0.5；在96 孔板中每孔加入200 μLTSB 和2 μL 菌液，盡量避免出現掛壁現象；于37 ℃的恒溫培養箱中靜置培養24 h；培養結束后，棄去TSB 培養基，用無菌PBS 溶液緩慢清洗，得到金葡菌成熟的生物膜體外模型。

1.2.4 使用結晶紫染液測量白花丹素對成熟生物膜的清除情況

得到生物膜體外模型后，棄去舊TSB 培養基，在孔板中分別加入預先用TSB 培養基稀釋好的白花丹素（512、256、128、64、32、16、8、4、0 μg/mL），每孔加入200 μL，每個濃度重復三組。藥物作用24 h后，吸棄培養基，加入無菌水輕柔潤洗一遍；加入200 μL 0.1%的結晶紫水溶液，室溫染色20 min，棄去染液，再用無菌水輕輕潤洗兩遍，置于烘箱中15 min 烘干，用30%的乙酸將其溶解，使用多功能酶標儀測量OD575。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.4.2 作圖，S 用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MIC 測定結果

實驗結果表明，白花丹素對MSSA 和MRSA 均有明顯的抑制作用，對MSSA 和MRSA 的MIC 分別為16 μg/mL 和8 μg/mL（見表1）。這表明在菌液中懸浮培養時，白花丹素對MRSA 的清除效果更佳。

表1 白花丹素對MSSA 和MRSA 的MIC、MBC

2.2 MBC 測定結果

實驗結果表明，白花丹素對MSSA 和MRSA 都具有明顯的殺傷作用，對MSSA 和MRSA 的MBC 均為32 μg/mL（見表1）。

2.3 白花丹素對MSSA 成熟生物膜的清除作用

當未使用白花丹素對其進行處理時，MSSA 菌群生長狀況良好，24 h 后生物膜的形成到達穩定期。在加入4 μg/mL 白花丹素的條件下，MSSA 菌群的生長開始受到抑制，OD575值下降至1.0 左右，且對濃度存在依賴性，濃度越高抑制作用越強；當白花丹素的質量濃度增長到128 μg/mL 時，菌群的生長能力下降更加明顯，OD575值可下降至0.5 左右；差值具有統計學意義（如圖1 所示，***P<0.001）。

圖1 白花丹素對MSSA 成熟生物膜的清除能力

2.4 白花丹素對MRSA 成熟生物膜的清除作用

未使用白花丹素進行處理時，MRSA 菌群的生長狀況良好，24 h 后生物膜的形成量趨于穩定。當加入的白花丹素的質量濃度達到32 μg/mL 時，MRSA 菌群的生長開始受到抑制，OD575值下降至0.7 左右，且對濃度存在依賴性，隨著白花丹素濃度升高，抑制作用逐漸增強；當白花丹素的濃度增長到512 μg/mL 時，OD575值可下降至0.5 左右，差值具有統計學意義（見圖2，**P<0.01、***P<0.001）。

圖2 白花丹素對MRSA 成熟生物膜的清除能力

3 討論

MSSA 是常見的食源性致病菌，其可引發食物中毒，給機體健康造成危害；還可以黏附到可植入的醫療設備上，引起生物膜感染。近年來，藥物濫用導致MRSA 大量產生，MRSA 與普通的金葡菌相比具有更強的生物膜形成能力。由細菌群落組成的復雜無底多細胞聯合體被稱為“生物膜”[6]，細菌在生物膜狀態下對抗菌劑的敏感性會降低，生長和代謝速度也會減緩，這導致金葡菌的治療更加困難，尋找可替代藥物進行治療迫在眉睫。

本實驗研究了白花丹素對MSSA 和MRSA 的體外抑菌效果，確定其在溶液中對兩種金葡菌均有顯著的抑制效果，對MRSA 的抑制效果尤其優秀，MIC 僅為8 μg/mL。在應對生物被膜狀態時，白花丹素也發揮了明顯的清除作用，但相較于MSSA，MRSA 的生物膜顯然更難被清除，這與其耐藥特性和獨特的群落感應系統有關，也是我們在后續實驗中需要多加關注的焦點；可以與其他藥物聯合使用，讓白花丹素更有效地作用于MRSA 的生物膜系統，從而全方位地對MSSA 造成殺傷。對白花丹素的抗菌效果進行深入研究，不僅有助于尋找抗生素的替代療法，而且能為研發新型抗菌藥物開辟新途徑。