藜霜霉病病原菌的鑒定

高國(guó)香，王 艷，2*，張 婷

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

藜（Chenopodium album L.）是莧科藜屬的一年生草本植物，別名“灰條菜”“灰灰菜”，常生于路旁、荒地及田間，在全國(guó)各地都有分布[1]。藜具有較強(qiáng)的抗逆性，常常與作物爭(zhēng)奪水分和養(yǎng)料，致使作物減產(chǎn)，是中國(guó)北方田間常見(jiàn)的雜草之一[2]。但由于其表面特殊的“鹽囊泡”結(jié)構(gòu)，具有耐干旱、抗鹽堿等優(yōu)良特性，有望用于改良鹽堿地[3]。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性與豆科、禾本科的牧草基本相似，因此亦有較高的飼用價(jià)值[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，藜含有揮發(fā)油、藜?jí)A、黃酮類(lèi)化合物、有機(jī)酸、多糖、甾醇等多種有效活性成分，具有抑菌、抗氧化、止癢、止瀉痢、治痢疾腹瀉的功效[5-9]，亦能預(yù)防貧血、促進(jìn)兒童生長(zhǎng)發(fā)育、為中老年人補(bǔ)充鈣質(zhì)[10]。發(fā)生在藜上的病害主要有葉斑病[11-12]、霜霉病[13-14]等。本文擬對(duì)甘肅省采集的藜霜霉病病原菌進(jìn)行鑒定，以期為病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)樣采集

本研究于2020 年8 月在甘肅省張掖市民樂(lè)縣南豐鄉(xiāng)秦家莊村（100°92′ E，38°27′ N，海拔2 681 m）進(jìn)行了對(duì)藜霜霉病的病害調(diào)查，描述了其癥狀并拍照記錄，采集了標(biāo)樣并壓制成了標(biāo)本。

1.2 病原菌形態(tài)鑒定

從干燥標(biāo)本發(fā)病葉片的背面刮取菌樣置于載玻片上，滴加一滴乳酸，蓋上蓋玻片，用酒精燈緩慢加熱，在顯微鏡（BX51-32H01，Olympus，日本）下觀(guān)察病原菌的形態(tài)，測(cè)定其大小，并拍照記錄。

1.3 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)尹玲等[15]的研究，本研究嘗試?yán)靡环N改良的CTAB 法提取病原菌的DNA。利用引物對(duì)ITS300/ITS4[16]、OomCoxI-Levup/OomCoxI-Levlo 和cox2-F/cox2-R 分別擴(kuò)增病原菌的ITS rDNA、cox1、cox2 mtDNA 片段。PCR 的反應(yīng)體系為20 μL，其中包括2×Taq PCR Mix 10 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 6 μL，將其混合均勻并離心，置于PCR 儀（Agilent Sure Cycler 8800，博日科技有限公司）中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，循環(huán)40 次；72 ℃延伸1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，所得目標(biāo)產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。登錄GenBank，將所得序列在NCBI 中進(jìn)行比對(duì)，下載相關(guān)序列，利用MEGA X 軟件中的鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征

藜霜霉病病原菌孢子囊呈褐色或淡褐色，形狀為圓形或橢圓形，長(zhǎng)23.75～35.36 μm（平均28.70 μm），寬18.74～28.69 μm（平均23.50 μm），分布較多，圖1 為藜霜霉病病原菌孢子囊的兩種不同形態(tài)。

圖1 藜霜霉病病原菌孢子囊形態(tài)

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株LSM 的cox1、cox2、ITS 基因序列測(cè)序得出其長(zhǎng)度分別為516 bp、381 bp、478bp，（登錄號(hào)正在提交），將三個(gè)序列利用BLAST 進(jìn)行比對(duì)后下載相關(guān)序列，構(gòu)建cox1-cox2-ITS 基因序列聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2 所示。從構(gòu)建完成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出，樹(shù)分為兩個(gè)大支，一支上的四個(gè)菌株分別為寄生在莧科植物菠菜Spinacia oleracea 上的P.effusa、寄生在莧科植物紅甜菜B. vulgaris subsp.vulgaris 上的P. schachtii、霜霉屬的模式種酸模霜霉、寄生在石竹科植物田野牛漆姑Spergularia rubra上的P. lepigoni；另一支為本菌（菌株“LSM”）與四個(gè)藜麥霜霉，分別為寄生在藜上的三個(gè)菌株菌株S2019-8、2018-1、10CHE 及寄生在藜麥上的菌株S2019-23?；诩闹髦参?、病原菌的形態(tài)特征見(jiàn)表1，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將該菌鑒定為藜麥霜霉菌Peronospora variabilis。

表1 cox1，cox2 和ITS 片段系統(tǒng)發(fā)育選用菌株Genbank 登錄號(hào)

圖2 藜霜霉病病原菌cox1-cox2-ITS 基因序列聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

本研究中的菌株與寄生在藜上的藜麥霜霉緊密聚類(lèi)在一起，共同與寄生在藜麥上的藜麥霜霉聚類(lèi)在一起，結(jié)合寄主植物和病原菌的形態(tài)特征，將本研究中的病原菌鑒定為藜麥霜霉菌。

藜霜霉病在世界各地均有發(fā)生，該病原菌最大的寄主植物藜麥?zhǔn)且环N古老的作物，營(yíng)養(yǎng)均衡，其種植現(xiàn)已遍布全球。但霜霉病會(huì)嚴(yán)重影響藜麥的生產(chǎn)，因此，了解病原菌的種類(lèi)，明確病原菌的特性是十分有必要的，能夠?yàn)椴『Ψ乐翁峁├碚撘罁?jù)。