畢赤酵母水解工藝的研究

袁稚雯，王士巖，2，朱小燕，2*，李相前，2*

1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省益生制劑重點建設實驗室，江蘇 淮安 223003

畢赤酵母（Pichia pastoris）作為單細胞真核生物之一，是能利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌[1]。酵母水解物（Yeast hydrolysates，YH）通過酵母與蛋白酶酶解得到，因為酵母細胞內富含蛋白質、礦物質、維生素等營養成分[2]，常用于微生物的培養和發酵[3]。隨著國內生物酶制劑的發展，現在可以使用生物酶法提取酵母浸出物和水解物[4]。酶促能夠加速細胞壁裂解，使其內部細胞營養物質被大量釋放[5]。外加酶能縮短水解時間，提高水解效率，達到酵母細胞壁溶解的目的，多種外加酶一起搭配作用，會有更好的破壁效果[6-7]。目前，我國在研究酵母水解物時，主要采用的方法有：鹽溶法、外加酶解法和復合促溶法[8-11]等。因能顯著提高酵母細胞營養物質的獲得率[12]，減少溶解所需時間，外加酶法已經成為當下的熱門使用方法[13]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種：畢赤酵母，為本實驗室保藏；

酶制劑：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶，購買于銳陽生物科技有限公司，詳情見表1；

表1 酶解酵母細胞所用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶

培養基配制：

YPD 液體培養基，酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，pH 自然，115 ℃滅菌20 min。

YPD 固體培養基，酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，pH 自然，115 ℃滅菌20 min。

在超凈工作臺中，將實驗室保藏的畢赤酵母菌株挑取一環菌劃線分離于YPD 固體培養基平板上，倒置于恒溫培養箱30 ℃培養48～72 h；挑取單個菌落放至5 mL YPD 試管培養基中，進行搖瓶培養，250 r/min，30 ℃，24 h；從5 mL YPD 試管培養基中吸取100 μL 菌液轉入100 mL YPD 培養基，進行搖瓶培養，250 r/min，30 ℃，24 h；將100 mL 菌液完全倒入1 L YPD 培養液中，進行搖瓶培養，250 r/min，30 ℃，24 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

酵母發酵液→洗滌離心（8 000 r/min）×3 次→洗凈的酵母泥→配制酵母懸浮液（包含4% NaCl）→自溶→滅酶（105 ℃，20 min）→冷卻離心→水解產物的檢測。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 酵母水解物中氨基氮的測定

將5 mL 上清液稀釋至100 mL，加水混合；然后，將20 mL 稀釋液加入燒杯，并在磁力攪拌器上加入60 mL 水；將0.05%氫氧化鈉標準溶液滴到pH 8.2，中和上清液中的游離酸。

加入10 mL 甲醛混合，并將0.05%氫氧化鈉標準溶液滴到pH 9.2，以測定氨基酸態氮。

空白實驗，在80 mL 水中加入0.05%氫氧化鈉標準溶液，并加入10 mL 甲醛，用于比較去氫氧化鈉的體積結果。結果將用于評估酵母水解物中游離酸和氨基酸態氮的含量，以研究酵母的代謝特性。

計算公式

式中：X 為樣品中氨基氮含量（mg/100 mL）；V1為空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.2 所用NaOH 標準溶液的體積（mL）；V2為樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至pH 9.2 所用NaOH 標準溶液的體積（mL）；C為氫氧化鈉的標準溶液濃度。

1.2.2.2 酵母水解物中固形物的測定

取酵母水解液10 000 r/min 離心10 min，取得5 mL 上清液放置105 ℃烘箱烘干至恒重。

計算公式

式中：M3為酵母在發酵后自溶并產生上清液的總質量（g）；W1為上清液中固體物質的含量（%）；M4為發酵過程中添加到反應中的外加物質（如營養物質等）的干重（g）；M2為發酵前酵母的干重（g）。

1.2.2.3 酵母水解物中蛋白質含量的測定

采用凱氏定氮法測定；樣品處理；將酵母水解物置于真空冷凍干燥機至恒重，備用。消化。

稱取干燥至恒重的酵母水解物0.1 g，移入干燥凱氏燒瓶中，加入0.2 g 硫酸鉀-硫酸銅混合物，并加入消化液5 mL 和玻璃珠1 粒，搖勻；將燒瓶至60°角固定在鐵架上，每個瓶口放一小漏斗，把操作放置于通風櫥內，使用電爐加熱消化，同時控制火力，不要讓液體沖到瓶頸，一般控制在200 ℃；待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，使瓶內液體微微沸騰，大約至400 ℃維持2～3 h；待消化液呈藍綠色澄清透明狀，再繼續加熱0.5 h；停火冷卻后，將消化液移入100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，備用；另取一干燥的凱氏燒瓶，以1 mL 蒸餾水替換干燥的酵母水解物樣品作為空白對照，其他操作均相同。

（1）標準硫酸銨樣品的蒸餾

先用標準硫酸銨溶液（0.3 mg N/mL）實驗2～3次；取3 個50 mL 的錐形瓶，分別準確加入2%硼酸5～10 mL，加入混合指示劑；用表面皿覆蓋備用；用吸量管吸取1 mL 標準硫酸銨溶液，由加樣漏斗傾入至反應室，再用1 mL 蒸餾水清洗漏斗；取1 個盛有硼酸-混合指示劑的錐形瓶，置于冷凝管下端，使冷凝管器管口下端浸沒在硼酸溶液的液面下，用量筒從漏斗加入30%氫氧化鈉5～10 mL，隨即將自由夾夾緊，漏斗加入少量蒸餾水作水封；加熱蒸汽發生器使其產生蒸汽，待第1 滴蒸餾液從冷凝柱下端滴下時，繼續蒸餾5 min，然后將錐形瓶放低，使導管離開液面再繼續蒸餾2 min，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管口外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸餾器洗凈。

（2）樣品消化液及空白液的蒸餾

取50 mL 錐形瓶數個，各加入2%硼酸溶液5～10 mL 和指示劑1～2 滴，用表面皿覆蓋備用；用吸量管分別吸取5～10 mL 樣品消化液和空白液，按照上述操作步驟進行蒸餾。

滴定：蒸餾完畢，用微量酸式滴定管，分別以0.010 0 mol/L HCl 標準溶液滴定，待錐形瓶內液體的顏色由藍綠色變為灰紅色（或淡紫色），即滴定終點。分別記錄樣品消化液蒸餾物及空白消化液蒸餾物的HCl 使用量，分別為V1和V2。

計算公式

式中：X 為樣品中蛋白質的含量（%）；V1為加入樣品后消耗的鹽酸標準液體積（mL）；V2為空白實驗消耗鹽酸標準液的體積（mL）；C 為鹽酸標準溶液的摩爾濃度，表示單位體積中含有鹽酸的物質的量（mol/L）；0.014 為每毫升鹽酸標準溶液中相當于氮的克數；m 為樣品的質量（g）；F 為氮換算為蛋白質的系數為6.25。

2 結果與討論

2.1 自溶對畢赤酵母破壁的影響

2.1.1 不同溫度對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖1 可知，在其他影響因素保持不變的情況下，溫度為50 ℃時，酵母細胞具有最高的氨基氮和固形物得率，這是細胞內酶活性的最佳溫度。因此，本實驗中的最佳破壁溫度為50 ℃，此時細胞具有最佳的破壁效果。

圖1 不同溫度對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.1.2 不同pH 對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖2 可知，在其他影響因素保持不變的情況下，當pH 為6.0 時，酵母細胞釋放的氨基氮和固形物得率最佳。因此，最適破壁的pH 為6.0。

圖2 不同pH 對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.1.3 不同懸浮液底物體積分數對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖3 可知，體積分數為10%時，自溶破壁效果最佳，酵母細胞的氨基氮和固形物得率最高。因此，本實驗中的最佳破壁懸浮液底物體積分數為10%。

圖3 不同懸浮液底物體積分數對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.1.4 不同作用時間對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖4 可知，在其他影響因素保持不變的情況下，當作用時間為30 h 時，酵母細胞的氨基氮和固形物得率最高。因此，本實驗中的最佳作用時間為30 h。

圖4 不同作用時間對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.2 不同蛋白酶對畢赤酵母水解的影響

實驗研究表明，相對于其他蛋白酶水解的研究，使用木瓜蛋白酶的效果最好。如圖5 所示，氨基氮得率為4.5%，固形物得率為59%。表2 可見，國際水解蛋白委員會關于酵母水解物化學指標中，對氨基酸的建議標準為>3.5%（不含NaCl），添加木瓜蛋白酶的效果能達到此標準，經木瓜蛋白酶水解產物的粗蛋白含量為45.38%。國際水解蛋白委員會對于酵母水解物化學指標當中總氮的建議標準為>9.0%（不含NaCl），因此，添加木瓜蛋白酶的效果能達到此標準。

圖5 不同蛋白酶自溶水解的影響

表2 酵母水解物的化學指標

2.3 木瓜蛋白酶水解條件的優化

2.3.1 添加量

蛋白酶的添加量對酵母自溶破壁存在一定影響，添加量不同對其破壁的影響程度不同。由圖6 可知，當木瓜蛋白酶的添加量在0.5%時，氨基氮得率為4.2%，固形物得率56%。故確定木瓜蛋白酶的添加量為0.5%。

圖6 木瓜蛋白酶的添加量對酶促溶的影響

2.3.2 pH

木瓜蛋白酶pH 在5.0～7.0，不同的pH 對其破壁的影響程度不同。由圖7 可知，pH 在6.0 時，氨基氮得率為4.0%，固形物得率55%。故確定pH 對木瓜蛋白酶的影響在6.0。

圖7 pH 對木瓜蛋白酶酶促溶的影響

2.3.3 溫度

木瓜蛋白酶的適宜溫度在50～58 ℃，不同溫度的影響如圖8 所示。當溫度在52 ℃時，氨基氮得率為4.5%，固形物得率為60%。故確定在52 ℃下木瓜蛋白酶作用效果最佳。

圖8 溫度對木瓜蛋白酶酶促溶的影響

2.3.4 作用時間

作用時間對于木瓜蛋白酶酶活起到的作用也不同，如圖9 所示。在作用時間為30 h 時，木瓜蛋白酶的酶活發揮最高價值，其氨基氮得率為4.5%，固形物得率為59%。相比其他作用時間，30 h 是最佳時間。

圖9 作用時間對木瓜蛋白酶酶促溶的影響

3 結論

研究發現畢赤酵母的自溶水解條件在50 ℃、pH 6.0，作用時間為30 h、4% NaCl，酵母懸浮液終體積分數為10%最佳，氨基氮得率為2.2%，固形物得率為30%。木瓜蛋白酶（8×105U/g）在添加量為0.5%、52℃、pH 6.0、作用時間30 h、4% NaCl、酵母懸浮液終體積分數為10%的氨基氮得率為4.5%，固形物得率為59%，粗蛋白含量為45.38%。