海上高溫W 油田硫化氫微生物成因分析

張世侖，王大威，黃 波，靖 波，王秀軍

1. 海洋油氣高效開發全國重點實驗室，北京 102209；2.中海油研究總院有限責任公司，北京 100028

硫酸鹽還原菌（Sulfate-Reducing Bacteria，SRB）是一類利用硫酸根離子（SO42-）作為末端電子受體進行能量代謝并產生硫化氫（H2S）的厭氧微生物的統稱。許多SRB 也具有利用單質硫、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等作為電子受體產生H2S 的能力。SRB 廣泛分布在海洋沉積物、稻田、深海熱泉、地下管道等厭氧或缺氧的環境中[1]。

向油藏中大量注水以提高地層壓力是油田開發的核心工藝技術之一。但是，隨著注水開發的不斷進行，注入水或驅油劑中含有的含硫化合物（SO42-）等物質大量進入油藏環境，這些物質能夠促進SRB生長繁殖，進而釋放大量H2S，導致石油開采、地面集輸系統的生產設備及管道腐蝕與損壞[2]。此外，硫化物會污染環境、危害身體健康，給油田帶來巨大的經濟損失。調查研究顯示，管道腐蝕每年給我國油田造成的直接經濟損失接近百億元，其中50%以上的經濟損失是由SRB 引起的[3]。

開發解決微生物腐蝕與硫化物污染問題的新方法，是石油工業新技術研究的前沿和熱點。南海W油田經過注水開發，已經有多個采出井出現了H2S濃度升高的現象。目前，我們對W 油田微生物多樣性、SRB 代謝活性的認識有限，對微生物在該油田環境中的生長繁殖和次生H2S 問題進行研究具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源。海上高溫W 油田A 區塊（油藏溫度：75～130 ℃）產出井A2、A3、A5 采出液和緩沖罐、過濾器、下岸口等地面管線流程節點。

試劑與實驗設備。Veriti Fast PCR 儀（Applied Biosystems，美國）、SPINeasyTM水樣基因組DNA 提取試劑盒（MP Biomedicals，美國）、PCR 反應混合物（大連寶生物工程有限公司，中國）、Illumina 測序平臺（北京奧維森基因科技有限公司，中國）、硫酸鹽還原菌測試瓶（北京華興世紀儀器有限公司，中國）、離子色譜儀ICS-6000（Thermo Fisher，美國）。

1.2 方法

采集樣品。取25 L 塑料桶，用95%酒精消毒3遍，開啟取樣閥，讓油田水樣流出10 min；將油水樣品裝滿單桶，盡可能排盡空氣，迅速將桶口密封，擰緊蓋子，運抵實驗室。

離子參數檢測。將樣品在14 000 r/min 的轉速下離心5 min，取上清液過0.22 μm 硝酸纖維素濾膜，回收濾液，注入樣品定量環，用淋洗液將樣品溶液帶入分析柱中，待測離子由于在柱子上的保留特性不同而分離開來，以保留時間進行定性，以峰高或峰面積進行定量，測定樣品中的離子含量。

微生物菌體收集。對于水相部分，采用離心法（14 000 r/min，5 min）收集微生物菌體；對于油相部分，與異辛烷混合溶解后，將所得單一相進行離心（14 000 r/min，15 min）以獲取沉淀；將上層液過0.22 μm 硝酸纖維素濾膜，收取菌體。

樣品DNA 提取。將菌液置于離心管內，14 000 r/min 離心10 min；將沉淀用1 mL Lysis 緩沖液沖洗，再用0.6 mL Lysis 緩沖液重懸，加入適量玻璃珠研磨1 min，再加入終質量濃度為10 mg/mL 的溶菌酶，37 ℃反應1 h；最后加入120 μL 20%的SDS，65℃反應1 h；后續提取操作步驟參照DNA 提取試劑盒說明書進行。

微生物群落組成分析。采用正向引物（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3’）、反向引物（5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’）對樣品DNA 進行16S rRNA 擴增[4]，反應體系（去離子水12 μL，2×PCR 反應混合物10 μL，正、反向引物各1 μL，DNA為1 μL），反應程序（預變性94 ℃，2 min；32 個循環：變性94 ℃，40 s；退火55 ℃，40 s；延伸72 ℃，1 min；終延伸72 ℃，15 min）；PCR 產物送至北京奧維森基因科技有限公司，在“科”“屬”水平上著重分析SRB 群落的組成多樣性及其相對豐度情況。

SRB 數量測定。采用最大可能計數法（most probable number，MPN）測定樣品中SRB 的數量，參照行業標準SY/T 0532—2012《油田注入水細菌分析方法絕跡稀釋法》，每個待測樣品設置10 個稀釋梯度（100～10-9），每個稀釋度設置3 個平行樣。接種后的測試瓶置于培養箱中，75 ℃恒溫培養30 d，然后根據測試瓶的變黑（產生H2S）情況，查詢MPN 表以確定SRB 數量。

2 結果與分析

2.1 樣品離子參數分析

獲得W 油田產出井（A2、A3、A5）采出液和地面流程節點（緩沖罐、過濾器、下岸口）樣品的離子參數信息，結果見表1。由表1 可知，產出井（A2、A3、A5）樣品的SO42-平均質量濃度為204.8 mg/L，地面三處節點樣品的SO42-平均質量濃度為202.0 mg/L，說明從產出端到地面管線流程中，SO42-維持在較高的濃度水平上，具備產生H2S 的物質基礎。

表1 樣品離子參數 單位（mg/L）

2.2 SRB 數量測定

在采用MPN 法計數的第30 天，獲得W 油田產出井（A2、A3、A5）采出液和地面流程節點（緩沖罐、過濾器、下岸口）樣品中的SRB 數量，結果見表2。產出井采樣點的SRB 數量為102～103個/mL，地面管線流程中的SRB 數量升高，達到104～106個/mL，呈現出空間差異性。

表2 樣品SRB 數量測定 單位（個/mL）

2.3 SRB 群落組成分析

選擇測序所得有效序列，與核糖體RNA 數據庫進行比對，獲得樣品微生物的菌種注釋信息。基于菌種注釋信息和有效序列的豐度，對樣品SRB 的多樣性與相對豐度情況進行分析。如圖1 所示，產出井（CC）中的SRB 共有12 種，在樣品微生物總量中占比26.32%，其中Desulfonauticus 和Desulfovibrio 占比最高，分別為11.59%和11.46%。地面流程（DM）中的SRB 共有19 種，在樣品微生物總量中占比54.57%，其中Desulfacinum 和Thermovirga 占比最高，分別為10.16%和15.20%。

圖1 SRB 豐度分布

圖2 揭示了該高溫油田中嗜熱型SRB 的相對豐度，產出井（CC）樣品中包含5 種嗜熱型SRB，分別為Archaeoglobus、Thermodesulfobacterium、Thermotoga、Thermovirga 和Thermodesulforhabdus，在樣品微生物總量中占比3.14%。與產出井相比，地面流程（DM）中新增了Desulfothermus 和Pseudothermotoga 兩種嗜熱SRB，共計7 種。這些嗜熱SRB 在樣品微生物總量中占比33.08%，其中Thermodesulfobacterium、Thermotoga、Thermovirga 及Thermodesulforhabdus 增幅顯著，占比由0.08%、1.14%、0.82%、0.01%分別增加至7.72%、2.17%、15.20%、6.72%。

圖2 耐溫嗜熱型SRB 豐度對比

如圖3 所示，地面流程組（DM）樣品的Chao1 指數、Observed species 值和PD whole tree 值均高于產出井（CC）樣品，表明地面流程組樣品的菌種豐富程度（菌種總數）高于產出井，而地面流程組樣品的Shannon 指數值低于產出井，意味著產出井的微生物多樣性更高，具有更大的發現新菌種的潛力。

圖3 產出井與地面流程組樣品微生物多樣性對比

3 結論

W 油田采樣位點處的SRB 數量較高，MPN 計數法結果顯示，產出井采樣點的SRB 數量為102～103個/mL，地面管線流程中的SRB 數量升高，達到104～106個/mL，呈現出空間差異性。高通量測序結果表明，W 油田水樣中的SRB 群落組成存在差異，在各個采樣位點中，均發現了高豐度的SRB，其為優勢微生物類群，產出井樣品中SRB 的相對豐度為26.32%，管線流程中SRB 的相對豐度上升至54.57%，且耐熱菌種的占比增幅顯著。

4 討論

本研究運用高通量測序技術解析南海W 油田產出井和地面管線流程中的微生物多樣性及SRB群落組成。研究結果為深入了解該高溫油藏的微生物多樣性提供了重要的數據支撐，也加深了人們對酸敗的海上油田環境中SRB 群落組成及空間異質性的認識。

然而，不同油田儲層的物理化學性質差異較大，導致采出水的水質、微生物群落組成差別也很大。同時，化學品的大量使用導致油氣儲層和開采系統的微生物群落結構發生改變，使得生物系統不穩定，難以預測。因此，有必要在更長的時間尺度上開展對該油田內源微生物多樣性的動態變化監測。

油藏內130 ℃的高溫并不能完全殺死SRB，這些微生物細胞可能會以芽孢休眠體的形式存在，在油藏內不具有產生H2S 的代謝活性[5]。但隨著采出液的運移，井筒環境溫度逐漸降低，SRB 恢復代謝活性并開始生長繁殖，逐漸成為優勢微生物種群，且多數為耐溫嗜熱型菌種（圖2）。圖中，Thermotoga 是嗜熱厭氧菌，能夠還原單質硫、硫代硫酸鹽[6]；Thermodesulfobacterium，熱脫硫桿菌，為嗜熱菌，將單質硫、硫酸鹽作為電子受體[7]；Thermovirga 能夠還原單質硫， 但無法還原硫代硫酸鹽[8]；Pseudothermotoga 以單質硫、硫代硫酸鹽為電子受體[9]。另外，本研究還發現了除常見SRB 類群以外的其他產硫化氫微生物Deferribacteraceae 為嗜熱菌，可利用單質硫作為電子受體[10]。上述這些硫/硫酸鹽還原微生物對該高溫油田次生硫化氫的貢獻值得研究。