一種基于類花菁檢測過氧化氫熒光探針的合成

陳小宜，鄧 璇，樊 輝，齊風佩

湖南城市學院材料與化學工程學院，湖南 益陽 413000

1 緒論

過氧化氫（H2O2）是生物體內維持生理平衡的使者，適量的H2O2可以發揮抗氧化作用，起到保護細胞的功能，同時可以調節細胞的呼吸過程和白細胞的活動，參與抗病毒和抗細菌的過程；然而過量的H2O2會引起氧化應激導致蛋白質、DNA 等生物分子的氧化損耗和細胞死亡，從而導致癌癥等各類疾病的發生[1-2]。因此，設計合成一種能夠快速檢測生理條件下H2O2濃度的熒光探針無論在醫學還是檢驗方面都具有極高的研究價值[3-4]。

常見的檢測H2O2的方法有熒光探針法、高效液相色譜，紫外-可見吸收檢測法、分光光度法、電化學方法、電子自旋共振法和質譜法等。熒光探針法因操作較為簡單、響應速度快、檢測效果準確、對生物體傷害小等優點而受到廣泛關注[5-7]。

花菁染料是科學家G.WiLLiams 于19 世紀60年代首次發現，并且因其似“玉米淀粉”藍色而被命名為“花菁”[8-9]。它是一種發色團共軛體子兩端建立在N-N 原子間的多甲川染料的衍生物。本文合成了一種類花菁的含苯并噻唑的熒光探針，并簡單研究了探針對H2O2的相應情況。

2 實驗部分

2.1 實驗儀器和試劑

旋轉蒸發器RE-52AAA（上海嘉鵬科技有限公司）；真空干燥箱DZ-2BCIV（天津市泰斯特儀器有限公司）；熒光分光光度計F-4600（日立公司）；紫外-科技分光光度計U-3010（日立公司）；三用紫外分析儀ZF7（鞏義市予華儀器有限責任公司）；核磁共振儀Avance Neo（400MHz，Bruker）。所用試劑都為分析純。

2.2 目標探針的合成

目標探針的合成路線見圖1。稱取0.119 6 g 3，5-二醛基-4-羥基苯甲酸乙酯（0.008 8 mol）和0.199 4 g 2，3-二甲基苯并噻唑碘化物（0.001 2 mol）于50 mL 圓底燒瓶中，加入10 mL 乙醇，并加入3 滴催化劑哌啶，加熱80 ℃反應24 h，旋干，柱層析提純（二氯甲烷∶甲醇=25∶1，V/V），得到紅色固體2（0.228 4 g，產率36.45%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：8.51（s，2H），8.12（s，2H），7.88（s，2H），7.30（s，2H），7.15（s，2H），6.99（s，2H），6.73（s，2H），4.52（s，6H），4.36（q，J=7.1 Hz，2H），1.37（t，J=7.1 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：14.8，43.5，63.7，104.3，116.8，120.2，123.3，125.6，127.2，129.9，132.1，134.1，136.3，139.2，141.2，158.9，161.1，175.4。

圖1 目標探針的合成路線

稱取0.243 9 g 化合物3 和0.240 7 g 催化劑碳酸銫于50 mL 圓底燒瓶中，加入15 mL 丙酮將其溶解，得到紅色溶液，35 ℃下加熱攪拌反應1 h 后，再加入0.59 g 4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯；待TLC 檢測反應結束后，旋干，柱層析提純，展開劑為二氯甲烷：甲醇=25∶1（V/V），得到目標探針（0.062 7 g，產率4.29%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：8.65 （s，2H），8.23 （s，2H），7.94 （s，2H），7.55（s，6H），7.35（s，2H），7.32（s，2H），7.17（s，2H），6.95（s，2H），6.78（s，2H），6.15（s，2H），4.55（s，6H），4.38（q，J=7.2 Hz，2H），1.34（t，J=7.2 Hz，3H），1.32（s，12H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：14.8，43.5，64.7，85.6，104.3，116.8，120.2，123.3，125.6，127.2，129.9，132.1，134.1，136.3，139.2，141.2，158.9，161.1，175.4。

2.3 熒光光譜測試

熒光光譜檢測條件：Ex=10.0 nm，Em=10.0 nm，U=700 V。探針最終濃度為10 μmol/L。使用熒光光譜儀分別測試探針在不同二甲亞砜：PBS 比例、不同丙三醇含量（黏度不同）條件下的熒光光譜。

3 結果與討論

3.1 探針在不同比例的二甲亞砜和PBS 溶液下的熒光光譜

探針在不同比例的DMSO-PBS 體系中的熒光強度如圖2 所示。在二甲亞砜∶PBS=1∶9 時，探針熒光強度最低；隨著二甲亞砜的含量逐步增多，探針的熒光強度逐漸增強；當二甲亞砜∶PBS=7∶3 時，熒光強度達到最高。為了更好地模擬生物體環境，在保證檢測效果的前提下，應該選擇PBS 含量盡量多一點的DMSO-PBS 體系。所以該實驗最終選擇二甲亞砜∶PBS=7∶3 的DMSO-PBS 體系。

圖2 探針在不同比例的DMSO-PBS 體系中的熒光光譜

3.2 探針對黏度的熒光響應

配置不同比例（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）的DMSO∶丙三醇溶液進行熒光檢測。如圖3 所示，隨著添加的丙三醇比例越來越大，溶液黏度逐漸增大，TICT 效應逐漸減弱，所以探針的熒光強度逐漸增強。因此，探針熒光強度會隨著黏度的增大而增強，且探針的熒光強度與丙三醇的比例變化呈線性關系。

圖3 探針在不同黏度下的熒光強度變化

3.3 探針對不同濃度過氧化氫的響應

在DMSO-PBS 混合體系（pH 7.4，7∶3，V/V）中探究探針對不同濃度H2O2的響應情況（圖4）。H2O2能與探針中的苯硼酸識別單元反應使其氧化為酚羥基，探針還原成花菁染料化合物4，化合物4 也可與H2O2反應，從而使化合物8 的熒光減弱，所以該實驗的熒光強度一直減弱。由圖4 可知，探針在520 nm 處的熒光發射強度與過氧化氫濃度在0～150 μmol/L 范圍內呈現出良好的線性關系。

圖4 探針和不同濃度過氧化氫反應熒光光譜

4 結論

本文通過三步反應合成了一種能夠檢測H2O2的苯并噻唑類熒光探針，并研究了該探針在不同溶劑、H2O2濃度、黏度條件下檢測H2O2的響應。結果表明，目標探針對H2O2響應的最佳條件為：二甲亞砜作溶劑、反應體系為DMSO-PBS（7∶3，V/V）體系；探針的熒光強度隨著丙三醇的逐漸增多而逐漸增強；探針對H2O2響應為：當H2O2濃度在0～150 μmol/L 之間時，探針的熒光強度與H2O2濃度呈良好的線性關系，當H2O2濃度達到150 μmol/L 時，探針熒光強度達到基本穩定狀態。