放牧強度對高寒草甸優勢植物葉片解剖結構的影響

肖 晴,林軫榮,姜風巖,石麗娜,趙洪鑫,李永元,祁進賢,黨志英,董全民,周華坤,邵新慶*

(1.中國農業大學草業科學與技術學院,北京 100193;2.青海省飼草料技術推廣站,青海 西寧 810000;3.青海省祁連縣野牛溝林場,青海 海北藏族自治州 810499;4.青海省祁連縣林場,青海 海北藏族自治州 810499;5.青海大學畜牧獸醫科學院,青海省畜牧獸醫科學院,青海省高寒草地適應性管理重點實驗室,青海 西寧 810016;6.中國科學院西北高原生物研究所,青海省寒區恢復生態學重點實驗室,青海 西寧 810001)

青藏高原是我國主要的牧區之一,草地類型豐富,高寒草地面積占我國草地總面積的44%[1]。近年來,由于氣候變化和超載過牧等原因,青藏高原高寒草甸出現了不同程度的退化現象[2],嚴重干擾著草地生態系統的穩定性和生態平衡。放牧是草地利用的主要方式之一[3]。在長期的放牧過程中,放牧家畜和草地植物之間存在著復雜的平衡關系。放牧導致的環境變異使植物在長期放牧過程中產生多種適應性進化機制[4],以保護其與非生物環境和放牧家畜的協調共存。放牧會改變草原植物群落的宏觀生理狀態,如高度[5]、豐富度[6]和生物量[7]等,而且對植物個體生長和形態特征產生不可忽略的影響[8,9]。

葉片是植物個體在生長發育過程中的重要器官,其形態和結構上往往存在變異性和可塑性[10]。以放牧為代表的人類活動不僅會通過放牧家畜的采食直接影響植株的器官和生長進程,還會改變植物生境中的關鍵環境因子(如溫度、土壤含水量、光照條件等),影響葉片的生長發育[11]。有關放牧強度對植物葉片的相關研究結果顯示,放牧強度的增加會導致短花針茅的葉面積表現出“小化”[12],并降低高原早熟禾葉片的木質部厚度[13];過度放牧導致部分植株葉角質層厚度增厚[14],角質層蠟質的組分與含量發生適應性變化[15]。長期放牧甚至會影響基因表達的可塑性,影響植物生理代謝途徑[16]。放牧壓力下植物所表現出的植物葉肉細胞密度[17]等形態特征的變化,反映了植物在異質生境下的適應性,即植物通過對可利用資源的重新分配[18],優化分配格局[19]讓部分器官可以獲得優先發育權[20],最終達到穩定植物體正常生長發育進程的目的。因此,研究植物葉片在放牧干擾下的解剖結構變化,更能反映植物對環境變化的差異性和可塑性。矮生嵩草(Kobresiahumilis)屬于莎草科嵩草屬多年生密叢型嵩草,紫花針茅(Stipapurpurea)屬于禾本科針茅屬多年生密叢禾草,二者作為高寒草甸的主要優勢植物,均具有良好的耐寒性、耐旱性和耐牧性等特性,是高寒草甸的主要建群種[21,22]。經過長期不同強度的放牧后,優勢植物除了在形態[3]和繁殖策略[23]等方面適應放牧外,葉解剖結構是否也受放牧強度影響尚不可知。

本研究以不同放牧強度下連續6年在生長季內(6—10月)持續放牧的兩種主要植物(即紫花針茅和矮生嵩草)為研究對象,通過分析不同放牧強度下葉片解剖結構的變化從微觀角度揭示植物對放牧干擾的響應,探討植物對放牧干擾產生的可塑性變化,這將有助于進一步揭示高寒草甸植物對放牧的適應機理,以期為植物微觀結構對放牧適應機制的進一步研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于青海省北州海晏縣西海鎮(36°44′～37°39′N,100°23′～101°20′E),平均海拔3 000～3 100 m。該地屬高原大陸性氣候,降水多集中在5—9月年平均降雨量為400 mm,年均溫為1.5℃,年日照時間為2 580～2 750 h。一年之中四季變化不明顯,僅有冷暖季之別[24]。研究區土壤類型為高山草甸土,草地類型為高寒草甸。樣地內植物群落主要優勢種為矮生嵩草(Kobresiahumilis)和紫花針茅(Stipapurpurea),次優勢種主要為干生薹草(Carexaridula)、星毛委陵菜(Potentillaacaulis)和草地早熟禾(Poapratensis)等。

1.2 放牧試驗設計

為控制本底和空間異質差異,本研究選擇地勢相對平坦、環境相對均勻的同一塊草地布設樣地。該放牧試驗采用完全隨機區組設計,共設置不放牧(Control,CK)、輕度放牧(Light grazing,LG)、中度放牧(Moderate grazing,MG)和重度放牧(Heavy grazing,HG)4個處理,每個處理設置3個重復。輕度放牧為3只·hm-2,牧草利用率為30%～35%,中度放牧為4只·hm-2,牧草利用率為50%～55%,重度放牧為5只·hm-2,牧草利用率為65%～70%。試驗中放牧家畜選擇體況相近的1歲左右公藏羊,體重為(30±2) kg,每只藏羊為1個羊單位。各處理的家畜數量和小區面積見表1。長期的放牧試驗平臺自2014年延續至今,于每年的6月份開始放牧,10月底結束放牧。放牧期間不進行補飼,在樣地內固定位置放置飲水槽,每隔2天加水1次,確保藏羊飲水充足[25]。

表1 放牧強度試驗設計Table 1 Experimental design of grazing intensity

1.3 取樣與測定

1.3.1試驗材料獲取 2021年8月下旬,分別在不同放牧強度處理小區內采集2種優勢種矮生嵩草(Kobresiahumilis)和紫花針茅(Stipapurpurea)葉片,每個小區內的2種植物分別隨機選取5叢植株,記為5個重復。選擇自上而下第1個完全展開的健康葉片,用卡尺測定植物葉片長度,記為植物葉長。取樣時,用剪刀剪取葉片靠近葉基部(標記為“B”)以及靠近葉尖端(標記為“T”)0.5～1.0 cm的葉段,分別記錄該葉段中點距葉尖的距離。將剪取的植物葉片立即放入FAA固定液(福爾馬林-70%酒精-醋酸混合液,體積比為5∶90∶5)中進行固定。將FAA固定液固定24 h后的植物葉片依次移入濃度為70%,85%,95%和100%酒精中(各2 h)進行脫水,并依次用100%純酒精和二甲苯混合液(1∶1,2 h)和純二甲苯(2 h)將葉片材料透明化,再用熔點為52℃～54℃的石蠟進行包埋。用連續切片機(Leica RM2235,Leica Inc.,Wetzler,Germany)切片,經蘇木精伊紅染色后制成永久切片。永久切片中葉橫切面用連接數碼相機(SPOT Insight,Diagnostic Instruments Inc.,Stirling Heights,MI,USA)的顯微鏡(Olympus CX21,Olympus Inc.,Tokyo,Japan)觀察并拍照獲取圖像,用Image-Pro Plus軟件進行顯微結構測定[26]。

1.3.2指標測定與方法 選取3～4個連續且完整的葉切片主脈處的葉片厚度均值記為該葉段切片的葉厚(Leaf thickness,μm)。選取3～4個連續且完整的葉切片主脈處同一部位的近軸面角質層、近軸面表皮細胞、遠軸面角質層厚和遠軸面表皮細胞的厚度均值記為該葉段切片的近軸面角質層厚(Adaxial cuticular thickness,μm)、近軸面表皮細胞厚(Adaxial epidermis thickness,μm)、遠軸面角質層厚(Abaxial cuticular thickness,μm)和遠軸面表皮細胞厚(Abaxial epidermis thickness,μm)。將同一個切片所測得的葉厚減去角質層厚以及表皮細胞厚所得到的厚度記為該切片的葉肉細胞厚,選取3～4個連續且完整的葉切片的葉肉細胞厚均值,記為該葉段切片的葉肉細胞厚(Mesophyll cell thickness,μm)。每個葉切片的最大導管直徑為視野中主脈木質部處的兩個大導管的直徑均值,最小導管直徑為視野中主脈木質部處2～3個小導管的直徑均值。選取3～4個連續且完整的葉切片的最大導管直徑與最小導管直徑的均值記為該葉段切片的最大導管直徑(Maximum xylem vessel diameter,μm)與最小導管直徑(Minimum xylem vessel diameter,μm)。選取3～4個連續且完整的葉切片主脈處的木質部以及韌皮部的面積均值記為該葉段切片的木質部面積(Xylem transection area,μm2)與韌皮部面積(Phloem transection area,μm2)。

圖1 測定指標示意圖Fig.1 Schematic diagram of the measured indicators注：1,近軸面角質層;2,近軸面表皮細胞;3,遠軸面角質層;4,遠軸面表皮細胞;5,葉肉細胞組織厚;6,葉厚;7,木質部;8,韌皮部Note：1,Adaxial cuticle;2,Adaxial epidermal cells;3,Abaxial cuticle;4,Abaxial epidermal cells;5,Mesophyll cell;6,Leaf thickness;7,Xylem;8,Phloem

1.4 數據處理

采用Microsoft excel 2016整理野外調查和室內測定所得數據。在數據分析前使用R軟件中的Stats包的shapiro.test函數進行Shapiro-Wilk正態分布檢驗,使用car包的leveneTest函數實現Levene方差齊性檢驗。采用單因素Kruskal-Wallis非參數檢驗對不同放牧強度下的同一取樣部位進行組間比較,當總體組間有統計學差異時,進一步使用FSA包的dunnTest函數進行Dunn test多重比較,P值校正方法選擇bonferroni法。同一放牧強度下的不同取樣部位間差異用wilcox秩和檢驗,采用Stats包的wilcox.test函數進行兩組間非參數差異分析。使用rcompanion包的scheirerRayHare函數對取樣部位和放牧強度進行雙因素Kruskal-Wallis非參數檢驗。顯著性水平設置為P<0.05。以上統計分析均在R 4.2.0(R Core Team,2021)中完成,圖表中數據為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 放牧強度對葉形態結構的影響

中度放牧下,矮生嵩草的葉長較不放牧處理下顯著減小了26.44%(圖2C,P<0.05);重度放牧下,紫花針茅和矮生嵩草的葉長較不放牧處理均表現出不同程度的減小,分別降低20.90%和22.89%,達到顯著水平(圖2A,C,P<0.05)。

2.2 放牧強度對葉解剖結構的影響

2.2.1放牧強度對葉光合組織的影響 隨著放牧強度的增加,紫花針茅葉基部的葉肉細胞厚逐漸降低;而矮生嵩草葉基部的葉肉細胞厚隨著放牧強度的增大而逐漸增厚(圖3)。除重度放牧外,紫花針茅的葉肉細胞厚在不同取樣部位之間均存在顯著差異(P<0.05)。矮生嵩草的葉肉細胞厚在取樣部位與放牧強度下均無顯著差異。

圖2 葉長和葉厚對放牧強度的響應Fig.2 Response of leaf length and leaf thickness to grazing intensities注：圖中為不同物種葉長(A,C;mm)、葉厚(B,D;μm)對放牧強度的響應;CK,對照;LG,輕度放牧;MG,中度放牧;HG,重度放牧;小寫字母分別表示在不同放牧強度之間的顯著性差異Note：The panels display the response of Leaf length (Panel A,C;mm) and Leaf thickness (Panel B,D;μm) to grazing intensities.CK,Control;LG,Light grazing;MG,Moderate grazing;HG,Heavy grazing.The different lowercase letters indicate a significant difference between the different grazing intensities

圖3 葉肉細胞厚對放牧強度的響應Fig.3 Response of mesophyll tissue cell thickness to grazing intensities注：圖中為不同物種葉肉細胞厚(A,B;μm)對放牧強度的響應;B,葉片基部位置;T,葉片尖端位置;CK,對照;LG,輕度放牧;MG,中度放牧;HG,重度放牧;大寫字母表示同一放牧強度下不同取樣部位之間的顯著性差異,小寫字母分別表示在同一取樣部位下不同放牧強度之間的顯著性差異。下同Note：The panels display the response of Mesophyll tissue cell thickness (panel A,B;μm0 to grazing intensities.B,Base of the leaf;M,Middle of the leaf;T,Tip of the leaf.CK,Control;LG,Light grazing;MG,Moderate grazing;HG,Heavy grazing.The different uppercase letters indicate a significant difference between different sampling sites under the same grazing intensity,and the different lowercase letters a significant difference between different grazing intensities in the same sampling site.The same as below

2.2.2放牧強度對葉保護組織的影響 不放牧處理下,紫花針茅葉尖端的近軸面角質層厚、近軸面表皮細胞厚以及遠軸面角質層厚均顯著大于葉基部(圖4A-C,P<0.05),隨著放牧強度的增大,不同解剖結構在不同取樣部位間的厚度關系受到干擾：僅重度放牧處理下,葉尖端的近軸面角質層厚顯著大于葉基部(圖4A,P<0.05);放牧干擾下兩部位間雖仍表現為葉尖端的近軸面表皮細胞厚高于基部,但差異縮小(圖4B);僅中度放牧下葉尖端的遠軸面角質層厚顯著大于葉基部(圖4C,P<0.05)。

對矮生嵩草的葉保護組織部分解剖結構進行分析發現,放牧強度和取樣部位對其近軸面角質層厚、近軸面表皮細胞厚以及遠軸面表皮細胞厚存在顯著影響。與不放牧處理相比,矮生嵩草葉尖端的遠軸面表皮細胞厚在中度放牧處理下減小了18.61%,且差異顯著(圖4H,P<0.05);其近軸面角質層厚在重度放牧處理下表現出顯著增厚(圖4E,P<0.05)。矮生嵩草葉尖端的近軸面表皮細胞厚在中度、重度放牧下較輕度放牧處理表現為顯著增大(圖4F,P<0.05)。不同取樣部位下的近軸面角質層厚在不放牧和輕度放牧下均存在顯著差異(圖4E,P<0.05);除輕度放牧處理外,其余處理條件下矮生嵩草不同取樣部位之間的近軸面表皮細胞厚均存在顯著差異,并且在中度放牧下二者差異達到最大,其頂端葉段高出基端葉段83.99%(圖4F,P<0.05);僅在中度放牧下,葉基端的遠軸面表皮細胞厚顯著大于葉尖端(圖4H,P<0.05)。

圖4 近軸面角質層厚、近軸面表皮細胞厚、遠軸面角質層厚和遠軸面表皮細胞厚對放牧強度的響應Fig.4 Response of adaxial cuticular thickness,adaxial epidermal cells thickness,abaxial cuticular thickness and abaxial epidermal cells thickness to grazing intensities

2.2.3放牧強度對維管組織的影響 除最小導管直徑外,紫花針茅葉尖端和葉基部間的葉片最大導管直徑、韌皮部橫截面積和木質部橫截面積均存在顯著性差異(圖5A-D,P<0.05)。矮生嵩草葉基部最大導管直徑在中度和重度放牧處理下較不放牧處理顯著分別降低了19.44%和17.16%(圖5E,P<0.05),但對葉尖端的最大導管直徑無顯著影響(圖5E)。在不放牧、輕度放牧和中度放牧處理下,矮生嵩草葉基部的最小導管直徑顯著高于頂端葉段,分別高出42.74%,40.42%和26.65%;重度放牧處理下矮生嵩草葉尖端與葉基部間的最小導管直徑則無顯著差異(圖5F)。矮生嵩草葉基部和葉尖端間的韌皮部橫截面積以及木質部橫截面積在不同放牧強度處理下均表現出顯著差異(P<0.05)。

2.3 取樣部位和放牧強度對不同物種葉解剖結構的影響

取樣部位和放牧強度對矮生嵩草的近軸面表皮細胞厚均具有顯著影響(P<0.05),且取樣部位對近軸面表皮細胞厚的影響大于放牧強度(表2)。取樣部位對矮生嵩草的近軸面角質層厚、木質部橫截面積、韌皮部橫截面積、最大導管直徑以及最小導管直徑均具有極顯著影響(P<0.001)。放牧強度與取樣部位的交互作用對矮生嵩草的遠軸面表皮細胞厚有顯著影響(P<0.05)。取樣部位對紫花針茅葉肉細胞厚、近軸面角質層厚、近軸面表皮細胞厚、遠軸面角質層厚、木質部橫截面積、韌皮部橫截面積及最大導管直徑存在極顯著影響(P<0.001)。

圖5 最大導管直徑、最小導管直徑、韌皮部橫截面積和木質部橫截面積對放牧強度的響應Fig.5 Response of maximum xylem vessel diameter,minimum xylem vessel diameter,phloem transection area,and xylem transection area to grazing intensities

表2 取樣部位和放牧強度對矮生嵩草和紫花針茅葉解剖結構的影響Table 2 Effects of different sampling sites and grazing intensities on the leaf anatomical traits of Kobresia humilis and Stipa purpurea

3 討論

3.1 放牧強度增大促使高寒草甸矮生嵩草和紫花針茅的葉形態結構趨向“小型化”

植物葉片直接暴露于環境之中,往往對環境變化非常敏感,植物對環境變化的響應往往最先由葉片表現出來[27],葉形態解剖結構則能夠很好地反映植物對環境變化的適應能力[28]。本研究中,中度放牧與重度放牧下均出現葉長的顯著減小,這說明在放牧干擾下,家畜對植物的過度采食會導致葉片變短,這與李江文等[12,29]的研究結果一致。葉厚可以作為植物抗逆性的反映指標,通常情況下抗逆性較強的植物葉厚較厚[30]。本研究中兩種植物的葉厚在不同的放牧強度均無顯著性差異,表明紫花針茅和矮生嵩草適應放牧的能力較強,與其耐牧性強的特性相吻合。

3.2 放牧下矮生嵩草和紫花針茅的葉解剖結構產生適應性變化

角質層及其蠟質是將水分散失限制在不受植物短期控制的安全值屏障,在控制CO2內流和水分外流中發揮關鍵作用[31],在抵御環境脅迫中起著重要作用。矮生嵩草葉尖端在中度放牧和重度放牧下較不放牧處理均表現為近軸面角質層增厚,并在重度放牧下達到顯著水平,葉基部的遠軸面角質層厚隨著放牧強度的逐步加強而漸漸增厚。這可能是矮生嵩草應對放牧干擾下的一種避牧策略,植物葉片角質層厚度與纖維素的含量呈正相關關系[32],而纖維素含量的增加會降低植物的適口性[27],從而減少被家畜啃食的概率。在重度放牧下,矮生嵩草的近軸面表皮細胞厚較不放牧處理出現增厚現象,可能是由于過度放牧下草地出現一定程度的退化,致使地表裸露面積增大、土壤水分蒸發加快,矮生嵩草為應對水分缺失的環境而表現出表皮細胞的增厚。對紫花針茅而言,除中度放牧下葉基部的近軸面角質層厚較不放牧處理表現為小幅度增大外,其余放牧條件下的角質層厚均出現減小現象。除此之外,紫花針茅的表皮細胞厚也表現出相似情況,說明紫花針茅的葉保護組織對放牧脅迫產生一定適應性變化,其抗旱性小幅度減弱,且角質層與表皮細胞的變化出現一致性。

導管作為植物水分疏導系統,導管直徑的微小變化對植物水分運輸效率都至關重要[33]。紫花針茅的最大導管直徑和最小導管直徑在重度放牧下較不放牧處理均減小,矮生嵩草葉基部的最大導管直徑在中度放牧和重度放牧較不放牧處理減小。這可能是因為放牧導致葉長的減小,葉長在一定程度上表示水分在葉間的運輸距離,而導管直徑與運輸路徑長度之間存在正相關關系,表現為顯著的異速生長關系[34]。異速生長指生物體某兩個性狀的相對生長速率不相同的現象,反映了生物體不同性狀間的相關性[35]。本研究中不同放牧強度下紫花針茅的最大導管直徑在不同取樣部位之間均表現出差異,而最小導管直徑也表現出基端粗、頂端較細的特點,進一步證實了葉片導管與運輸距離之間的冪指數關系[34]。

3.3 矮生嵩草和紫花針茅對放牧的響應存在敏感性差異

不同物種的葉片形態結構對環境的響應敏感性存在極大差異[36]。將植物葉形態結構的響應程度作為衡量植物對放牧敏感性的標準,在植株個體普遍矮小、植物表型不易區分的草原地區更具科學性[37]。本研究中,重度放牧顯著改變了紫花針茅和矮生嵩草的葉長,說明兩種植物的葉長對放牧表現出較強的敏感性,這與Mclntir等[38]的研究結果一致。除此之外,放牧改變了矮生嵩草的近軸面表皮細胞厚,降低了最大導管直徑,但增加了近軸面角質層厚,這表明除葉長外,放牧壓力下近軸面角質層厚、近軸面表皮細胞厚以及最大導管直徑也屬于矮生嵩草的敏感性指標[39]。在放牧干擾下,矮生嵩草的葉長以及最大導管直徑均減小,近軸面角質層厚和近軸面表皮細胞厚增加,體現了葉長與最大導管直徑、近軸面角質層厚和近軸面表皮細胞厚之間的協同變化。非對稱響應,即部分指標在同一放牧干擾下的相異變化,而本研究中葉長與最大導管直徑、近軸面角質層厚和近軸面表皮細胞厚表現出的不同的變化趨勢,便是矮生嵩草非對稱性響應機制的體現,這點與馮斌等[40]的研究結果一致。除葉長外,紫花針茅的各項葉片結構均不受放牧影響,屬于惰性性狀[40]。這可能是由于在放牧干擾下,紫花針茅為保證自身葉片光合作用不受影響,對體內營養物質進行了分配優化,更傾向于維持地上部分的正常生理結構及功能[41],從而表現出葉結構上的相對穩定。在放牧干擾下,矮生嵩草的葉長、近軸面角質層厚、近軸面表皮細胞厚以及最大導管直徑均表現為敏感性指標;而紫花針茅的各項葉解剖結構指標中僅葉長對放牧強度表現出較強的敏感性。對比認為,矮生嵩草和紫花針茅對放牧的敏感性不同,矮生嵩草葉片對放牧刺激的響應更為敏感。

4 結論

放牧壓力下高寒草甸優勢植物為適應環境變化產生多種適應性進化機制以保護其與非生物環境和放牧家畜的協調共存。植物應對放牧干擾會通過改變葉形態結構以及保護組織等重要葉結構以適應放牧壓力,表現出較強的結構可塑性。其中,矮生嵩草對放牧刺激的響應較紫花針茅更加靈敏。矮生嵩草各項敏感性指標對放牧表現出非對稱響應以適應放牧壓力,而紫花針茅葉解剖結構相對穩定。