蒺藜苜蓿miR167c調控生長和花器官發育的功能驗證

張立霞,李 霄,許 蕾,旦真措,劉亞嬌,蘇德畢力格,叢麗麗,楊青川,龍瑞才*

(1.青島農業大學,山東 青島 266109;2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193;3.北京林業大學,北京 100083)

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為20～24個核苷酸的內源性非編碼小RNA。植物miRNA基因(MIRs)由RNA聚合酶Ⅱ轉錄成具有莖環結構的初級轉錄本,經過一系列剪切過程形成成熟的miRNA[1-3],以序列特異性方式切割或抑制mRNA的翻譯來調節靶基因的表達[4]。miRNAs主要通過調控生長素響應因子(Auxinresponsefactor,ARF)和IAA-氨基酸水解酶(IAA-Alaresistant3,IAR3)基因發揮作用[5-9],參與調控根、莖、葉和花的發育、開花時間、胚胎發育、種子發育和脅迫響應等,在植物的生理和形態建成過程以及響應各種逆境脅迫中發揮著重要作用[10-17]。

miR167是植物中高度保守的基因家族之一,具有不同的莖環前體并產生成熟的miR167序列。在miR167序列中,3′端加工與5′端加工存在顯著差異,初級miR167和成熟miR167在植物中具有不同的表達模式[18-20]。miR167家族主要存在于被子植物中,且在雙子葉植物中比在單子葉植物中更廣泛,目前在大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、小麥(TriticumaestivumL.)、龍眼(Dimocarpuslongan)和甘蔗(Saccharumofficinarum)等植物中已被鑒定。miR167具有物種特異性,如在擬南芥4個miR167基因(MIR167a,MIR167b,MIR167c和MIR167d)中,miR167a產生較高水平的miR167成熟體,是miR167基因家族的主要成員,能調節雌雄器官的發育[7,15]。水稻(Oryzasativa)miR167家族由10個miR167a-j位點編碼,miR167a-c和miR167-j在3′端僅有一個核苷酸差異。在這10個基因中,MIR167a,MIR167b和MIR167c能更高效地產生成熟的miR167,其中miR167a-c在水稻中發揮主要作用,影響植株大小和分蘗數。在大豆中,miR167家族有11個高度保守的同源miRNA,可分為miR167a/b/d/e/f/g/h/i/j/k和miR167c兩個亞組,miR167初級轉錄本由不同的基因產生,成熟的miR167在3′端或5′端只有一個或兩個核苷酸的差異,miR167介導了大豆的結瘤作用[10]。

miR167可以靶向不同的靶基因參與植物生長發育的調控,而miR167切割靶基因是一種常見的轉錄后調控方式。生長素響應因子是調控生長素響應基因表達的轉錄因子,它可以與生長素響應基因啟動子區的生長素響應元件(Auxin response element,AUXRE)“TGTTC”結合,激活或抑制生長素響應基因,并與第二個轉錄因子家族AUX/IAA阻遏蛋白相互作用,誘導生長素響應[21-23]。ARF轉錄因子包含三個結構域：保守的B3家族N端DNA結合結構域(DBD)可以激活或抑制基因的表達的非保守的中間區域以及保守的C端結構域(CTD)[24]。ARF的C端結構域與AUX/IAA蛋白的III和IV結構域相似[25]。ARF和生長素(Auxin,AUX)吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)可以通過該結構域形成二聚體[26]。ARF家族成員的數量因物種而異,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[27]和水稻[28]中分別有23和25個ARF家族成員。在番茄(Solanumlycopersicum)[29]、玉米[30]、油菜(Brassicanapus)[31]、大豆[32]和木薯(Manihotesculenta)[33-34]等植物中也鑒定到ARF基因。生長素在從種子胚胎發生到植物衰老的整個生命過程中發揮重要作用,其功能主要由ARF和AUX/IAA[35-36]介導。生長素響應因子ARF6和ARF8在營養器官和生殖器官的發育中起保守作用,調控根和莖的發育、雄蕊花絲的伸長、花藥的開裂、雌蕊的成熟和開花時間[37-39]。在擬南芥中,miR167靶向AtARF6/8基因的互補位點并進行剪切來調控花藥和胚珠的正常發育[7]。酰胺水解酶家族成員IAR3也被證明是miR167的靶基因[8],擬南芥IAA酰胺水解酶家族包含7個基因,包括IAR3,ILL1,ILL2,ILL3,ILL5,ILL6和ILR1[40]。IAR3是一種編碼IAA-Ala的水解酶,可以從無活性的IAA-Ala中釋放具有生物活性的生長素,調節植物體內的生長素平衡,并受茉莉酸(Jasmonic acid,JA)的誘導[41],在根、莖和花中表達最強。

近年來,miR167因其在調控植物生長發育和非生物脅迫中的作用而被廣泛研究。實驗室前期研究表明,在蒺藜苜蓿中過表達Mt-miR167c,導致植株矮化,果莢變小[42]。為了進一步明確miR167c的生物學功能和可能的調控機制,本研究根據蒺藜苜蓿miR167c合成了其互補序列,構建海綿載體,抑制miR167c的表達。Mt-miR167c與At-miR167c僅前兩個堿基存在差異,故兩者均可受到海綿序列的抑制。由于擬南芥生長周期短,優先探究了At-miR167c在擬南芥中的功能,并對其進行靶基因表達量檢測和轉基因擬南芥表型分析,明確miR167c參與擬南芥株型和花器官發育分子機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養

擬南芥種子(生態型Col-0)用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min,無菌水清洗6～7次后種于1/2 MS固體培養基中,于4℃春化2 d后,移入人工氣候培養箱中(溫度22℃/20℃,相對濕度60%,光照16 h/黑暗8 h)培養14 d后,將其移入土(營養土∶蛭石=2∶3)中生長。

1.2 miR167c靶基因的預測與篩選

利用在線網站psRNAtarget(http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget)預測At-miR167c靶標基因,將最大期望值設置為5.0,依據評分結果進行篩選。

1.3 miR167c海綿序列的設計與合成

研究表明,miR167家族在不同物種中具有較高的保守性,且蒺藜苜蓿miR167c與擬南芥中miR167a/b/c/d的序列相似度為93.96%,Mt-miR167c與At-miR167c僅前兩個堿基存在差異[41]。在miR167c成熟體的互補序列設計2個堿基凸起,以防止RNA干擾型切割和海綿RNA被蛋白Argonaute 2(AGO2)降解。為提高結合效率,將海綿序列設置10次重復,并用4個相同的堿基進行分隔。為避免與海綿序列的第一個及最后一個核苷酸重復,使用了4個胸腺嘧啶殘基作為間隔。另外,在海綿序列兩端加上與pCAMBIA3301載體連接的接頭序列。將所設計序列發送至生物公司進行合成。

1.4 海綿載體構建與擬南芥遺傳轉化

利用無縫克隆試劑盒(CloneSmarter)將海綿序列連接至pCAMBIA3301載體,將pCAMBIA3301-miR167c-Sponge轉化至DH5α感受態細胞(Vazyme)中,挑取陽性單克隆送至生物公司測序。轉化測序正確重組載體至GV3101農桿菌感受態細胞(華越洋生物)。用YEB液體培養基將農桿菌培養至OD600值為0.6～0.8,離心收集菌體,用5%蔗糖溶液(含0.02% SilwetL-77)重懸浮菌體,采用花序侵染法轉化擬南芥,收獲T0代種子備用。

1.5 轉基因擬南芥的陽性鑒定與At-miR167c的表達量分析

在含有4 mg·L-1草銨膦的1/2 MS固體培養基中初步篩選T0代轉基因陽性擬南芥植株,轉入土培15 d后提取葉片DNA,以35S-F和Sponge-R為引物(表1)進行PCR陽性鑒定。使用Trizol提取轉基因擬南芥的總RNA,使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN)反轉錄,以U6和At-miR167c成熟體序列為引物(表1),用miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(TIANGEN)進行miRNA的實時熒光定量檢測,鑒定不同轉基因株系中At-miR167c的表達水平。試驗設置3個生物學重復,2-ΔΔCT方法進行表達量數據分析,LSD檢驗進行顯著性分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 轉基因擬南芥植株At-miR167c靶基因表達量分析

Trizol法提取T2代轉基因擬南芥的總RNA,反轉錄(UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR,Genesand)后,進行實時熒光定量(aq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix,Vazyme)檢測,鑒定轉基因株系中At-miR167c靶基因的表達水平。試驗設置3個生物學重復,2-ΔΔCT方法進行表達量數據分析,LSD檢驗進行顯著性分析。

1.7 轉基因擬南芥表型分析

T2代幼苗由培養基移至盆土中記作1日齡,觀察統計超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥植株的開花時間、花序數和花苞數,并測定植株生物量、蓮座葉數、株高、分枝數和果莢數。

1.8 數據統計與分析

采用Excel 2016統計分析實驗數據,結果以平均值表示。IBM SPSS Statistics 25、Excel 2016和Graphpad Prism進行數據分析與制圖。

2 結果與分析

2.1 At-miR167c靶基因預測結果分析

利用在線軟件psRNAtarget預測At-miR167c的靶標基因,結果顯示擬南芥miR167c有105個靶基因,選擇評分較高的ARF6/8、類受體蛋白激酶家族蛋白(Receptor-likeproteinkinase-relatedfamilyprotein,RPK)和IAR3基因(表2)作為后續研究對象。

表2 At-miR167c的靶基因預測Table 2 Target genes prediction of At-miR167c

2.2 miR167c-Sponge海綿載體模式圖

在pCAMBIA3301載體中,將與miR167c成熟體互補的海綿序列插入由CaMV 35S啟動子驅動的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)報告基因的5′端,構建miR167c海綿抑制表達載體P35S：miR167c-Sponge(圖1)。海綿序列由中間間隔4個胸腺嘧啶的10個miR167c成熟體互補序列串聯排列,其中以4個胸腺嘧啶殘基作為間隔,長度為246 bp。

圖1 miR167c-Sponge海綿載體模式圖Fig.1 Pattern diagram of miR167c-Sponge vector

2.3 轉基因擬南芥陽性鑒定和At-miR167c及其靶基因表達量分析

構建P35S：miR167c-Sponge載體,采用花序侵染法轉化擬南芥。轉基因擬南芥T1代種子在含4 mg·L-1草銨膦的1/2 MS培養基上進行初步的陽性篩選,挑選正常發芽的幼苗移栽至花盆中。待轉基因株系生長至10 d后,提取葉片DNA后進行PCR陽性檢測。PCR結果顯示,共鑒定出12個miR167c-Sponge過表達陽性轉基因株系(圖2A)。隨機選擇其中的5個T2代轉基因株系,通過RT-qPCR在轉錄水平檢測轉基因株系中At-miR167c的表達水平。結果顯示,與野生型相比,所選的5個轉基因株系中At-miR167c的表達水平均下降(圖2B),且不同株系中表達水平存在差異。miR167c-Sponge過表達轉基因株系L3中的At-miR167c表達量最低,較野生型(WT)降低53.6%;株系L7次之,表達量降低46.4%;其余株系的表達量相較于WT降低10.9%～43.8%。

圖2 轉基因擬南芥的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of the transgenic Arabidopsis注：A,轉基因擬南芥抗性植株PCR檢測;B,轉基因擬南芥中At-miR167c的相對表達量。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),下同Note：Panel A,PCR assay of transgenic Arabidopsis resistant plants;Panel B,Relative expression of At-miR167c in transgenic Arabidopsis.Different letters indicate a significant difference at 0.05 level,the same as below

選取轉基因株系L3和L7為后續研究對象,并鑒定At-miR167c潛在靶基因的表達水平。RT-qPCR結果顯示,在兩個轉基因株系中,4個靶基因表達水平與WT相比均顯著升高(圖3)。其中,靶基因At-ARF6表達水平在轉基因株系L3和L7中分別較野生型增加86.4%和67.0%(圖3A);At-ARF8的表達量分別為WT的2.09倍和2.41倍(圖3B)。轉基因株系L3中At-RPK和At-IAR3表達量分別為WT的2.81倍及2.85倍(圖3C,3D),在株系L7中,At-RPK和At-IAR3表達水平分別為WT的1.78倍和2.47倍。miR167c-Sponge過表達轉基因株系L3和L7中,At-miR167c相對表達量降低1倍左右,而At-miR167c靶基因表達量上調1倍以上。

圖3 轉基因擬南芥At-miR167c靶基因表達量鑒定Fig.3 Expressional identification of the target genes of At-miR167c in the transgenic Arabidopsis

2.4 超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥表型分析

觀察轉基因擬南芥開花時間發現,超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥開花時間早于WT(圖4)。相同生長條件下,WT在移栽至花盆18.6 d后開花,而轉基因株系L3和L7開花時間分別為14.3 d和15.0 d,平均開花時間較WT分別提前4.3 d及3.6 d(圖4A,4C),表明抑制At-miR167c的表達可能影響了轉基因株系的開花時間。在轉錄水平檢測轉基因擬南芥中開花相關基因At-REM16、At-SOC1和At-FT的表達水平。RT-qPCR結果顯示,在兩個轉基因株系中,3個開花相關基因的表達水平與野生型相比均顯著升高(圖5)。其中,At-REM16表達水平在轉基因株系L3和L7中分別較WT增加70.4%和47.0%(圖5A);At-SOC1的表達水平分別較WT增加46.3%和39.2%(圖5B)。在轉基因株系L3和L7中,At-FT的表達量分別為野生型的1.48倍和2.00倍(圖5C)。同時,還觀察到超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥的花器官形態發生變異,與WT相比,生長30 d的轉基因植株花序緊湊,花苞數量增多(圖4B)。WT在開花12 d后的花苞數為42.3個,而株系L3和L7的花苞數量分別為80.0個和81.3個,其數量增加了近1倍(圖4D)。除此之外,轉基因擬南芥的花序數量也明顯增加(圖4E,4F)。轉基因擬南芥L3和L7兩個株系(35 d)的花序數量分別為8.3個和8.6個,而野生型的花序數僅4.3個(圖4F),轉基因株系花器官的數量較對照增加了近1倍。上述結果表明,At-miR167c可能對擬南芥花器官的發育起到重要的調控作用。

21日齡的超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥的蓮座葉數量增多,葉片增大。轉基因擬南芥株系L3及L7的蓮座葉數平均值分別為30.3片和31.0片,而WT蓮座葉數為19.3片(圖6B)。轉基因株系L3和L7的蓮座葉面積明顯增大(圖6A),葉片平均鮮重分別為0.453 g及0.502 g,而WT葉片平均鮮重為0.132 g(圖6C);株系L3,L7和WT的平均干重分別為0.058 g,0.067 g及0.022 g(圖6D)。以上結果表明抑制At-miR167c的表達可一定程度上促進擬南芥葉片生長。

超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥的株型也表現出明顯差異,主要表現在株高和分枝數方面(圖7)。轉基因擬南芥L3及L7株系的植株高度顯著增加,其平均株高為47.6 cm和45.6 cm,分別比野生型植株高出16.3 cm和14.3 cm(圖7C)。株系L3,L7的植株分枝數平均值為11.6個和11.0個,而WT的分枝數為6.0個,僅為轉基因植株的一半(圖7B)。以上結果表明,At-miR167c表達水平下調可能促進擬南芥株高和分枝數的增加。

在本研究中,我們還發現轉基因擬南芥成熟期的果莢數量顯著增加。統計結果顯示,WT的果莢平均數為106.6個,轉基因株系L3,L7的果莢平均數分別為235.6,223.0個(圖8D),轉基因株系的果莢數量分別為野生型的2.20倍和2.09倍。結果表明,At-miR167c可能對擬南芥的生殖生長也有重要作用。

3 討論

miR167廣泛存在于植物中,在調控植物生長發育過程中發揮著重要作用。本研究構建了miR167c的海綿互補序列,獲得了過表達miR167c海綿互補序列的轉基因擬南芥植株,并對轉基因株系的表型進行了觀察和統計,探究了miR167c在擬南芥生長發育中的調控作用。初步研究結果表明,miR167可能通過調控其主要靶基因ARF6/8和IAR3的表達,參與調控擬南芥株型和花器官的發育,在擬南芥的營養生長和生殖生長階段發揮重要調控作用。

開花是植物由營養生長向生殖生長過渡的重要過程,是開花植物生殖繁育的關鍵環節,受植物內在因素和環境條件的協同調控[43]。有研究表明,通過人工miRNA靶標模擬技術合成與miR167堿基互補的靶標模擬物(MIM167)轉化擬南芥,導致ARF6/8表達量上調和晚花表型[45]。與此研究結果一致,擬南芥miR167a缺失突變體同樣表現出開花延遲的表型[15]。而本研究中,超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥中ARF6/8表達量上調,但出現了與報道結果相反的早花表型。靶基因預測結果顯示,AP2/B3類轉錄因子家族蛋白基因(AP2/B3-liketranscriptionalfactorfamilyprotein)為At-miR167c的潛在靶基因(表2)。有研究表明,REM16轉錄因子作為AP2/B3類轉錄因子家族成員之一,在開花途徑中作用于開花激活基因SOC1和FT的上游,通過直接激活SOC1和FT促進開花[46]。本研究認為,miR167c可能通過介導REM16的表達來調控擬南芥的開花時間,而REM16的過量表達正是促進開花的原因之一。At-miR167c的表達受抑制后REM16的表達水平升高(圖5A),同時激活SOC1和FT,從而增加二者的表達量(圖5B,5C)促進擬南芥開花。

擬南芥的花序調控是一個復雜的過程,當生長過程轉換到生殖生長階段,其營養生長的莖尖分生組織轉變為生殖生長的花序分生組織。目前尚未有研究報道miR167對花序的調控作用。但有研究表明,miR172通過抑制其靶基因APETALA2(AP2)的表達,調控花序分生組織細胞的大小和數量,進而影響花器官發育[47]。在本研究中,At-miR167c的預測靶基因AP2/B3為AP2基因編碼的AP2/ERF轉錄因子的一個亞族[48]。AP2/ERF參與調控花序分生組織的大小、花芽的分化和花器官生長發育的過程[49]。由此推測,海綿序列抑制At-miR167c的表達后,其靶基因AP2/B3的表達量上調,促進了花序分生組織的形成與花苞的分化,增加了過表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥花序和花苞的數量。

在胚胎發育早期,種皮中生長素的生物合成增加。有研究報道,miR167靶向ARF6/8影響胚胎發育過程中生長素的合成與局部運輸,從而調控擬南芥體胚發生[50]。本研究發現,超表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥的果莢數較野生型增加了近1倍,相應地,其種子產量也增加了1倍,該結果可能與miR167c的靶基因ARF6/8的表達量增加有關。研究發現,生長素輸入載體基因OsAUX3控制果莢粒長和粒重增加,而OsARF6是OsAUX3的上游轉錄因子,OsARF6可以直接與OsAUX3啟動子上的生長素響應元件結合,通過調控OsAUX3基因的轉錄,改變籽粒細胞的縱向生長以及生長素的分布和含量來控制籽粒長度[51]。由此推測,本研究中轉基因擬南芥可能同樣通過miR167c-ARF-AUX網絡調控果莢的發育。

miR167還參與調控植物營養器官的發育,如在轉基因水稻中過表達miR167,OsARF6/12/17/25的轉錄水平會顯著降低,導致轉基因水稻植株矮化,分蘗數顯著減少[11]。在番茄中過表達miR167a降低了細胞長度,增加了細胞數量,且最終節間和葉片皺縮[37]。本研究發現,在擬南芥中過表達miR167c-Sponge,At-miR167c表達水平顯著降低,轉基因擬南芥株高增加,分枝數增加。ARF在信號轉導途徑中與AUX/IAA基因相互作用,參與植物激素信號傳導途徑[52],調控植物生長的多種過程。其中,生長素是調控植物生長發育最重要的激素之一[53]。吲哚-3-丙酮酸(Indole-3-pyruvate,IPA)途徑是植物體內IAA生物合成的主要途徑,廣泛存在于大多數植物體中。有研究表明,YUC是IAA生物合成途徑的關鍵限速酶編碼基因[54]。At-miR167c靶基因的預測結果中沒有YUC基因,但是,在Mt-miR167c靶基因預測結果中發現了YUC6,后期將檢測該基因在超表達miR167c-Sponge轉基因蒺藜苜蓿中的表達量及生長素含量,重點解析miR167c、靶基因YUC6和生長素含量三者的關系,進一步探究miR167c在調控植物生長過程中的作用。

4 結論

本研究在擬南芥中超表達海綿載體miR167c-Sponge,降低了轉基因擬南芥中miR167c的表達水平,并初步分析了轉基因株系中其預測靶基因At-ARF6,At-ARF8,At-RPK和At-IAR3的表達水平。過表達miR167c-Sponge轉基因擬南芥開花提前,花序和花苞數量增多,株高增加,分枝數量和果莢數量均增多。研究結果表明miR167c可能在植物生長發育過程發揮重要調控作用,對解析miRNA介導的植物株型和花器官發育調控機制提供了更多依據。