三種百里香揮發油成分、抑菌活性和對人體肝癌細胞毒性研究

韓 峰,孫耀文,馬迎梅*,鄭麗娜,劉承昊,趙博揚

1內蒙古農業大學草原與資源環境學院;2內蒙古農業大學沙漠治理學院;3內蒙古蒙草生態環境(集團)股份有限公司,呼和浩特 010000

百里香是唇形科(Lamiaceae)的一種小半灌木,廣泛分布于內蒙古、黑龍江等地。百里香揮發油是百里香特有的揮發物質,它的含量因生長環境和種類會有差異,大多為萜烯類和芳香族類化合物,其中百里香酚和香芹酚的含量最高[1,2]。百里香揮發油因其有很好的抗氧化作用,所以在食品添加劑和美容護膚品中廣泛應用,又因其對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠傷寒沙門氏等致病菌具有很強的抑制作用[3],所以在醫藥領域也頗受關注,雖然有關植物揮發油誘發癌細胞凋亡的機制已有較多的文獻報道,但是對于百里香屬植物揮發油的研究報道較少,對其如何導致癌細胞壞死和凋亡的研究鮮有報道,也缺乏系統研究。

本研究以檸檬百里香(Thymuscitriodorus)、百里香(Thymusmongolicus)、法國百里香(Thymusvulgaris)為材料,采用水蒸氣蒸餾法提取三種百里香揮發油,結合氣相色譜?質譜聯用技術(GC-MS)分析其化學成分,研究其抑菌作用和對肝癌細胞毒性的影響,為進一步綜合開發百里香揮發油提供更多的基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

百里香采集于內蒙古大青山,檸檬百里香和法國百里香購于山東新泰市綠色農業科技園,經內蒙古農業大學李紅老師鑒定確認,并將其置于室內陰涼處,待自然陰干后粉碎過80目篩;鐮刀菌由東北農業大學植物教研室提供,保存于-80 ℃冰箱;所用試劑均為分析純,購于無錫市亞泰聯合化工有限公司。

1.2 百里香精油提取

采用水蒸氣蒸餾法提取百里香揮發油[4]。百里香整株通風陰干,粉碎保存待用。取百里香粉末20 g,置于1 000 mL圓底燒瓶中,加蒸餾水600 mL混勻,室溫下浸泡1 h。之后將圓底燒瓶,置于可調式電熱套中,加熱至沸騰,進行蒸餾1 h。將收集到的混合物倒入分液漏斗中靜置,待油水分離,從分液漏斗下部放出冷凝水,獲得百里香精油。

1.3 百里香精油GC-MS分析

色譜條件:色譜為HP-5MS,5%苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度為250 ℃,程序為初始溫度50 ℃(5 min),以8 ℃/min升溫速率至150 ℃(保持10 min),10 ℃升至250 ℃(保持8 min),載氣為高純氦氣,柱前壓20 kPa,流速1 mL/min,分流比37∶1。

質譜條件:接口溫度為280 ℃,電離方式為EⅠ,電子能量為70 eV,離子源溫度250 ℃,四極桿溫度130 ℃,調諧方式為標準調諧,質量掃描方式為SCAN,溶劑延遲為3 min,掃描范圍為35～550 amu。

1.4 菌懸液制備

將鐮刀菌接種于營養肉湯中,培養至對數生長期,將對數生長期的菌種接種于PDA固體培養基中,37 ℃下培養24 h。將菌體配制成濃度為1×106～1×107CFU/mL的菌懸液,備用[5]。

1.5 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

利用二倍稀釋法和打孔法測定百里香精油的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[6]。用二倍稀釋法分別配制不同濃度的精油溶液,百里香揮發油用吐溫-80溶液稀釋,吸取100 μL菌液均勻涂布到無菌平板上,37 ℃恒溫培養12 h后,以5 mm打孔器對菌平板進行打孔,分別加入100 μL百里香揮發油、鏈霉素、蒸餾水作為藥物組、陽性組、陰性對照組。在恒溫箱中培養,利用十字交叉法測定抑菌圈直徑,每組試驗做3個重復,最終結果取3次試驗平均值。向96孔培養板內加入適量菌液,加入百里香精油,將培養板放入37 ℃培養箱內培養24 h,以最后一個不顯示濁度,細菌無生長的藥液稀釋度作為MIC。吸取該濃度混合液20 μL,再涂布于平板,置于27 ℃恒溫培養箱中培養24 h,若平板仍然完全沒有菌株生長,則該濃度即為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。

1.6 人體肝癌細胞培養

將凍存人體肝癌細胞復蘇后,在T25細胞培養瓶中于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,之后每天觀察細胞生長狀況,待其單層生長至鋪滿細胞瓶底部,記錄其生長天數。

1.7 CCK-8法檢測

選用對數生長期的貼壁肝癌細胞,用胰酶消化后,用含10%小牛血清、1%雙抗的DMEM培養基配成5 000個/mL的細胞懸液,接種在96孔培養板中,每孔接種200 μL,37 ℃,5% CO2培養。至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)。棄液后,用PBS清洗2遍。在試驗組分別加入100 μL不同濃度的精油溶液,陰性對照組和無細胞組加入等體積的DMSO,藥物培養基組加入含有1 μg/mL精油的DMSO。將加百里香精油后的96孔板放入細胞培養箱中培養,培養時間要大于細胞傳代時間。棄去培養基,每孔加入100 μL含有10%的CCK-8培養液,顯色相應時間后,用酶標儀測定在450 nm處的吸光度,所有實驗重復3次,以Bliss法計算揮發油對人體肝癌細胞的IC50值[7,8]。

2 結果與分析

2.1 三種百里香葉揮發油成分比較

檸檬百里香、百里香和法國百里香揮發油的總離子流圖(total ions chromatogram,TIC)見圖1～3。

圖1 檸檬百里香葉揮發油總離子流圖

圖2 百里香揮發油總離子流圖

圖3 法國百里香葉揮發油總離子流圖

以面積歸一化法確定三種百里香揮發油中各成分相對質量分數,并結合NIST數據庫與標準質譜圖進行成分鑒定,從揮發油中鑒定出50個匹配度大于等于90%的成分(見表1)。由表1可以看出,3種百里香揮發油的主要成分和相對質量分數有一定差異,共鑒定出50種化合物[9]。其中,檸檬百里香中酚類化合物相對質量分數最多(37.88%),其次為醇類(27.57%)和醛類(13.56%),萜烯類和酮類化合物組分少,不含醚類化合物;此外,檸檬醛和異檸檬醛僅存在于檸檬百里香揮發油中,二者相對質量分數總和為13.56%。百里香揮發油共鑒定出29種化合物,占總質量分數的92.91%,其中酚類化合物相對質量分數為32.05%、萜烯類為21.92%、醇類為14.77%;主要成分為百里香酚(30.48%)、異百里香甲醚(12.45%)、芳樟醇(5.21%)等;法國百里香揮發油共鑒定出30種化合物,占總含量的90.01%;其中酚類化合物相對質量分數為33.93%、萜烯類為22.11%、醇類為14.96%,主要成分為百里香酚(32.17%)、異百里香甲醚(9.78%)、芳樟醇(4.17%)、石竹素(3.70%)等。

表1 三種百里香揮發油化學成分及其相對質量分數

2.2 三種百里香揮發油的抑菌作用

通過不同濃度的百里香揮發油處理三種不同的菌株,獲得最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)結果見表2。從表中可以看出,百里香屬植物揮發油普遍都有很好的抑菌作用,其中檸檬百里香揮發油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和燕麥鐮刀菌的抑菌活性最強,且比陽性對照鏈霉素的效果好,其MIC值分別是366.4、549.6和732.8 μg/mL,法國百里香揮發油抑制作用最弱,百里香揮發油的抑菌效果,則介于以上兩種揮發油之間[10]。同時,三種揮發油對不同菌株均表現出很好的殺菌活性[11],檸檬百里香揮發油對于真菌(燕麥鐮刀菌)的殺菌作用強于陽性對照,其他兩種揮發油都弱于陽性對照組。

表2 三種百里香揮發油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.3 三種百里香揮發油對人體肝癌細胞毒性作用

三種百里香揮發油對肝癌HepG2細胞有很強的毒性作用(見圖4),并呈現一定的劑量依賴性[12],在所用劑量下作用HepG2細胞48 h,檸檬百里香揮發油的IC50值為18.32 μg/mL、百里香為45.75 μg/mL、法國百里香為73.36 μg/mL。由圖5可知,隨著濃度增加三種百里香揮發油對HepG2細胞的抑制率逐漸增強,表現出明顯的差異性,檸檬百里香的抑制率最強,法國百里香最弱。

圖4 三種百里香揮發油對肝癌細胞HepG2的劑量—反應關系

圖5 不同濃度下三種百里香揮發油對肝癌細胞HepG2的抑制率

3 討論與結論

從芳香植物中提取獲得植物揮發油,因對人體相對安全,毒性低、易降解和綠色環保的特征,被作為化學殺菌劑的有效替代品和抑癌劑。不同的藥用植物,其揮發油的組成成分均不相同,一般來說主要含各種萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮含硫化合物等。目前,針對百里香揮發油有效成分在抗腫瘤方面的研究較少,本研究采用傳統的水蒸氣蒸餾法獲得三種百里香揮發油,通過GC-MS分析其成分上的差異,其中最為明顯的是檸檬百里香揮發油中有檸檬醛和異檸檬醛兩種化合物,而另外兩種揮發油中則沒有這兩種物質[13,14],試驗利用三種百里香揮發油處理不同的植物病原菌,發現它們在抑菌方面表現出不同的能力,其中檸檬百里香揮發油的抑菌效果最好,尤其對大腸桿菌的抑制作用最為明顯。相比之下,法國百里香揮發油的抑菌能力較弱,百里香揮發油次之。試驗還通過CCK-8法分析其對肝癌細胞系增殖和凋亡的影響,結果發現三種百里香揮發油能夠顯著抑制肝癌細胞HepG2的增殖,并誘導其凋亡,在抗腫瘤藥物開發方面具有一定的研究潛力。這種抑菌和抗癌功能與百里香屬揮發油的組成成分密切相關,其中含量最多的百里香酚不僅對植物真菌、皮膚癬菌和人體炎癥療效顯著,還顯示出了良好的抗腫瘤藥理活性,例如,百里香酚可從絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細胞外調節蛋白激酶(ERK)和凋亡基因Bax等方面誘導肝癌細胞、前列腺癌細胞和胃癌細胞凋亡,并通過降低線粒體跨膜誘導細胞產生ROS,增強Caspase的表達和下調Bcl-2的表達,來增加MAPK和ERK磷酸化等途徑發揮抗癌作用[15]。此外,還有檸檬醛可通過誘導氧化應激反應,提高細胞內丙二醛水平降低還原型谷胱甘肽,誘導引起白血病細胞凋亡,還可以通過上調促凋亡蛋白BAK表達和下調抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達來抑制淋巴瘤細胞的增殖,阻滯細胞周期抑制乳腺癌細胞增殖[16]。Zhao等[17]用薰衣草精油對人肝癌細胞HepG2的生長抑制作用,結果顯示薰衣草精油能明顯抑制HepG2細胞的增殖,并呈濃度依賴性,處理后,不同質量濃度的薰衣草精油作用HepG2后出現明顯的凋亡細胞群及壞死細胞。Jia等[18]發現檸檬烯可以提高Bax和細胞色素的含量,降低Bcl-2的表達,誘導人結腸癌細胞LS174T凋亡;Jaganathan等[19]證實酚能通過活化p53和Caspase-3,誘導結腸癌細胞凋亡。

天然植物揮發油是一個極具潛力的生物資源,隨著對百里香屬植物揮發油研究的深入,將會為臨床醫學、醫藥護理和食品安全方面提供更多的可能性,為研制新的天然抗氧化劑和抗腫瘤藥物開辟新途徑。