芝麻Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的全基因組鑒定與分析

張文香 崔文寧 高小寬 梁魁景

(衡水學院生命科學學院，河北 衡水 053000)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種活性氧清除劑，植物在遇到逆境脅迫時便會產生大量的活性氧物質，影響植物的生長發育，因此超氧化物歧化酶活性的提高，有助于提高植物的抗逆性。從分子水平了解超氧化物歧化酶基因的特性，對于優良抗性基因的發掘以及植物抗性品種的選育均有重要的作用。根據超氧化物歧化酶的輔因子的不同，可以分為鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、鎳超氧化物岐化酶(Ni-SOD)和銅/鋅超氧化物岐化酶(Cu/Zn-SOD)[1，2]。其中，Cu/Zn-SOD是植物體內含量最豐富，功能也最重要的一種活性氧清除酶[2]。目前，研究者已在多種植物中克隆到了Cu/Zn-SOD基因，并發現逆境可以誘導該基因的表達，提高植物的抗逆性。

芝麻(Sesamum indicum)具有豐富的營養價值和保健價值，被稱為“油中皇后”。芝麻具有較好的耐貧瘠性，因此在多省份廣泛種植，隨著人民生活水平的提高，芝麻需求量日益增長[3]。干旱是制約芝麻產量的重要影響因素之一，因此本研究通過鑒定分析芝麻Cu/Zn-SOD基因，為芝麻抗性基因的挖掘提供基礎[4]。

1 材料與方法

1.1 芝麻銅/鋅超氧化物歧化酶基因的鑒定

根據Wang等[5]公布的基因組數據，下載芝麻全基因組序列(https：//doi.org/10.6084/m9.figshare. 21151948)，同時在TAIR網站下載擬南芥Cu/Zn-SOD基因的蛋白序列作為參考序列，通過本地blast篩選得分值≥100的候選蛋白序列。

1.2 蛋白質理化性質與結構域預測

在EXPASY(https：//web.expasy.org/protparam/)預測芝麻Cu/Zn-SOD蛋白序列的分子量、氨基酸數量、等電點、親水性、脂肪系數、不穩定系數等性質；通過GSDS2.0(http：//gsds.gao-lab.org/)在線預測基因結構；在InterPro(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/result/InterProScan/)網站進行蛋白結構域預測；在TMHMM(https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM)網站進行跨膜區預測；利用SignalP(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)進行信號肽預測；利用Cell-Ploc 2.0(http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進行蛋白的亞細胞定位預測。

1.3 序列比對和進化樹構建

下載擬南芥(Arabidopsis Thaliana)、水稻(Oryza sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)、煙草(Nicotiana plumbaginifolia)等的Cu-Zn SOD蛋白序列，利用MEGA軟件構建進化樹，首先進行ClustW比對，然后采用NJ的方法構建進化樹，bootstrap選擇1000，其它為默認值。

2 結果與分析

2.1 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族成員的鑒定及理化性質分析

以擬南芥Cu/Zn-SOD的蛋白序列，本地Blast芝麻全基因組蛋白序列，共鑒定出4條Cu/Zn-SOD序列，分別命名為SiCSD1、SiCSD2、SiCSD3、SiCSD4，對應的蛋白ID分別為Sesame03845.t1、Sesame19088.t1、Sesame15283.t1、Sesame06096.t1，對應染色體編號分別為3號、10號、9號和4號染色體，見表1。蛋白序列長度從165個氨基酸到245個氨基酸不等，其中，SiCSD1和SiCSD4蛋白序列最短，均為165個氨基酸，SiCSD2最長為245個氨基酸。等電點為5.6～6.92，說明均為酸性蛋白質。親水性除SiCSD3為正值外，其余均為負值，說明SiCSD3為疏水蛋白質，其余3條為親水蛋白質。脂肪系數為77.39～95.75，不穩定系數為13.66～34，說明蛋白均較穩定，見表1。

表1 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族蛋白的理化性質

2.2 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族成員的基因結構與蛋白結構域分析

根據基因注釋文件，通過GSDS軟件繪制芝麻Cu/Zn-SOD基因的結構圖，結果如圖1a所示，外顯子和內含子的數量各不相同，SiCSD4的外顯子數量最多，為10個；SiCSD2的外顯子數量最少，為7個；SiCSD1、SiCSD3分別含有9個和8個外顯子。在InterPro網站進行結構域預測，發現4條蛋白序列均含有Cu/Zn-SOD結構域和Cu2+、Zn2+結合位點，見圖1b，跨膜結構域預測發現4條蛋白都不是跨膜蛋白，見圖2，除SiCSD1預測到可信度較低的信號肽序列外，其他3條蛋白都未預測到信號肽序列，見圖3。

圖1 基因結構與結構域預測

圖2 跨膜結構預測

2.3 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族成員二級結構與亞細胞定位預測

通過SOPMA在線預測芝麻Cu/Zn-SOD蛋白的二級結構，結果發現，3條蛋白都是無規則卷曲含量最高，48.86%(SiCSD3)～58.18%(SiCSD4)。延伸鏈含量次之，25.71%(SiCSD2)～32.12%(SiCSD4)。除SiCSD3外，都是α-螺旋含量最低，β-轉角次之；SiCSD1的α-螺旋含量最低，為3.03%，SiCSD3的α-螺旋含量最高，為15.07%，SiCSD4的β-轉角含量最低為5.45%，SiCSD1的β-轉角含量最高為7.88%，見表2。在Plant-mPLoc網站對芝麻Cu/Zn-SOD蛋白的亞細胞定位進行預測，SiCSD1-3都定位于葉綠體，SiCSD4定位于葉綠體和細胞質，見表2。

表2 蛋白二級結構與亞細胞定位預測

2.4 芝麻Cu/Zn-SOD基因的進化樹分析

利用MEGA軟件，將芝麻的4條Cu/Zn-SOD基因的蛋白序列(SiCSD1-4)與擬南芥(At CSD1-2)、水稻(OsSODC1-2)、番茄(SlSODC1-2)、煙草(NpSODC)進行比對并構建進化樹，見圖4，結果發現，SiCSD3與AtCSD2聚為1支，SiCSD4與AtCSD3聚為1支，SiCSD1和SiCSD2與NpSOODC、SlSODC1、SlSODC2聚在1個大的分支。

圖4 進化樹分析

3 結論與討論

本研究通過全基因組水平的本地blast，獲得4條芝麻Cu-ZnSOD基因，通過序列與理化性質的分析，對其序列長度、基因結構、亞細胞定位、進化關系等有了一定的了解，可以幫助后續對其功能的驗證。

植物在遭受逆境脅迫時，體內活性氧升高。SOD是清除活性氧，幫助植物抵抗逆境脅迫的重要酶系統之一。其中，Cu/Zn-SOD又是植物體內含量最豐富、功能也最重要的一種SOD，目前對其研究也比較廣泛，已在小麥[6，7]、棉花[8]、茶樹[9]等多種作物進行全基因組水平的SOD基因鑒定。Han等在丹參全因組水平鑒定出3條Cu/Zn-SOD基因[10]。Zhou等在茶樹全基因組中鑒定出7條Cu/Zn-SOD基因，發現其在抵抗干旱脅迫時可能發揮主要的作用[9]。Han等在日本落葉松中鑒定出4條Cu/Zn-SOD基因，其中3條的蛋白序列(LkSOD1，LkSOD3和LkSOD4)定位于細胞質，1條定位于葉綠體[11]，與本研究中芝麻Cu/Zn-SOD類似。Cui等克隆了白菜Cu/Zn-SOD基因(BcCSD1)，發現其在葉片中表達量最高，在根中的表達量最低，不同逆境脅迫處理都能誘導BcCSD1的表達量升高，尤其ABA處理表達量升高最明顯[12]。Liu等發現，將麻風樹的Cu/Zn-SOD基因在擬南芥中異位表達，能夠增強擬南芥的耐鹽性[13]。綜上所述，Cu/Zn-SOD已在多種植物中驗證對提高植物的抗逆性有著重要作用。

本研究對Cu/Zn-SOD基因序列的鑒定與分析，將為后期基因的克隆、載體構建、基因功能驗證以及芝麻抗逆基因資源的獲取等提供一定的研究基礎。