胸腔積液lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9水平對肺腺癌的診斷價值*

邢貞泉,趙光強,李柳霞

三亞市人民醫院/四川大學華西三亞醫院呼吸內科,海南三亞 572000

肺癌是發病率、死亡率均較高的惡性腫瘤,大部分患者確診時已進入中晚期,5年總生存率低于10%[1],提高早期診斷率和及時干預是改善肺癌患者預后的重要內容。非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型,其中約50%為肺腺癌,目前臨床主要采用病理活檢或影像學手段進行早期診斷,但均存在一定局限性[2]。相關報道顯示,肺癌是引發胸腔積液的主要因素,而隨著無創分子診斷技術的發展,為胸腔積液中腫瘤特異性分子標志物來診斷惡性腫瘤提供了更多選擇[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類不編碼蛋白質但參與腫瘤發生發展調控的RNA,能進入胸腔積液、血液等體液中穩定表達,目前已經在肺癌診斷及預后評估中發揮作用。lncRNA膀胱癌相關轉錄本1(BLACAT1)、lncRNA癌癥易感性候選物9(lncRNA CASC9)均已發現在多種惡性腫瘤中高表達,但關于其在肺腺癌胸腔積液中表達的相關研究較少[4-5]。本研究通過檢測肺腺癌患者胸腔積液中lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9表達,分析其對肺腺癌的鑒別診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月本院收治的96例肺腺癌合并胸腔積液患者作為肺腺癌組,其中男50例,女46例;年齡36～78歲,平均(58.72±10.36)歲;臨床分期:Ⅰa期9例,Ⅰb期14例,Ⅱa期28例,Ⅱb期21例,Ⅲa期18例,Ⅲb期6例。納入標準:(1)經病理學或細胞學診斷為原發性肺腺癌[6],且影像學診斷存在胸腔積液;(2)標本采集前未進行放化療、免疫治療等。排除標準:(1)存在胸腔引流禁忌證者;(2)合并嚴重肝腎功能障礙、心腦血管疾病者;(3)存在其他惡性腫瘤;(4)患者病例資料不全、不配合進行檢查或主動退出者。另選取該院同期收治的82例肺部感染合并胸腔積液患者為對照組,其中男43例,女39例;年齡34～80歲,平均(59.19±9.38)歲;肺結核53例,肺炎29例。兩組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會審核通過,所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2胸腔積液采集方法 兩組患者均采用胸腔引流術干預并提取胸腔積液標本20 mL,1 060 r/min離心5 min后取沉淀;在沉淀中加入紅細胞裂解液吹打,并于室溫放置5 min,隨后以520 r/min離心5 min后取沉淀;在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打洗滌,并以1 060 r/min離心5 min,可根據血紅素含量重復該步驟,最后獲得的沉淀采用Trizol試劑吹打,并在-80 ℃保存備用。

1.3實時熒光定量PCR(qPCR)檢測胸腔積液lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9表達水平 將凍存的標本室溫放置解凍,取其中500 μL沉淀加入100 μL 氯仿(CHCl3)溶液混勻后放置5 min,隨后以12 000 r/min離心10 min,取白色沉淀并加入75%乙醇清洗,隨后采用7 970 r/min離心5 min后棄去上清液,沉淀在室溫下干燥至無色透明,隨后將其溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)中,測定提取的總RNA的純度。根據相關引物序列逆轉錄合成cDNA,并以此作為模板進行PCR反應。反應條件:預變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火60 ℃ 5 s,延伸60 ℃ 5 s,共40個循環。每個標本重復測3次,lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9相對表達水平以2-ΔΔCt表示,內參基因為GAPDH。引物序列:lncRNA BLACAT1上游引物為5′-GGAGATGTGCTGGTGGTGGAATG-3′,下游引物為5′-GTTATGGAGGAGGCTGGGAGAGAG-3′;lncRNA CASC9上游引物為5′-GGCTGGAGAGTCATTGGCACTATC-3′,下游引物為5′-GCTTCCATTGCTTTGCTGCTGTC-3′;GAPDH上游引物為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游引物為5′-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′。

2 結 果

2.1肺腺癌組和對照組胸腔積液lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9表達水平比較 肺腺癌組胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9相對表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9 比較

2.2不同臨床病理肺腺癌患者胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9表達水平比較 以lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9在96例肺腺癌患者中相對表達水平的平均值(分別為1.72、6.63)為臨界值,將患者分為高、低表達兩組,其中lncRNA BLACAT1表達與肺腺癌患者臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關(P<0.05),lncRNA CASC9表達與患者臨床分期、分化程度有關(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征肺腺癌組患者胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9表達比較(n)

2.3胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯合診斷肺腺癌模型 采用Logistic回歸模型建立胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯合鑒別診斷肺腺癌模型:Logit(P)=1.933×lncRNA BLACAT1+0.448×lncRNA CASC9-3.987。見表3。

表3 胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯合診斷肺腺癌模型

2.4lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9對肺腺癌的診斷價值 建立ROC曲線,分析結果顯示胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9診斷肺腺癌的曲線下面積(AUC)分別為0.782、0.789,二者聯合檢測的AUC為0.878,高于單項指標診斷。見表4。

表4 胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9對肺腺癌的診斷價值

3 討 論

肺癌是目前發病率和病死率增長最快的惡性腫瘤之一,早期無特異性臨床癥狀,病理活檢是其診斷的金標準,但部分患者接受度不高[7-8]。胸腔積液是肺腺癌常見并發癥,標本獲取更為簡單,且對其進行細胞病理學檢測也是臨床診斷的重要依據[9]。近年來,隨著臨床檢測技術的不斷進展,胸腔積液中腫瘤標志物表達情況檢測為惡性腫瘤診斷提供了新的途徑。

lncRNA表達異常與腫瘤發生發展及預后不良有關,lncRNA BLACAT1是一種定位在染色體1q32.1上的具有促癌作用的lncRNA,目前已經發現其在結直腸癌、宮頸癌、膀胱癌等惡性腫瘤患者血清及癌組織中表達上調,且血清lncRNA BLACAT1表達對大多數腫瘤的診斷效能更高[10-12]。目前關于lncRNA BLACAT1在NSCLC患者中表達的研究主要集中在癌組織及體外實驗中。有研究發現,NSCLC患者組織中lncRNA BLACAT1表達高于健康人,且lncRNA BLACAT1高表達患者總生存期明顯短于低表達患者[13];相關細胞實驗顯示,lncRNA BLACAT1高表達能促進肺癌細胞增殖及上皮間質轉化[14]。本研究檢測了肺腺癌患者及肺部良性病變患者胸腔積液lncRNA BLACAT1的表達,結果發現肺腺癌組胸腔積液lncRNA BLACAT1相對表達水平明顯高于對照組,且與肺腺癌患者臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關,證實了lncRNA BLACAT1在肺腺癌患者中表達上調,這可能來自胸膜上轉移的腫瘤細胞產生lncRNA BLACAT1并將其釋放到胸腔積液中[15]。有研究發現,干擾lncRNA BLACAT1基因表達能通過上調miR-374b-5p來抑制肺腺癌細胞A549的增殖及轉移相關蛋白基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達[16];還有研究顯示,下調lncRNA BLACAT1在耐藥NSCLC細胞中表達后能逆轉細胞對阿法替尼耐藥性[17]。以上研究均證實,lncRNA BLACAT1與肺腺癌發生及進展有關。本研究中,ROC曲線分析結果顯示,lncRNA BLACAT1診斷肺腺癌的AUC為0.782,提示其在肺腺癌診斷中具有一定的臨床價值。

lncRNA CASC9也是一種常見的促癌lncRNA,目前已經發現其在NSCLC組織及細胞中高表達,且其在癌組織中表達水平與患者生存期有關[18]。有研究顯示,lncRNA CASC9能通過調控miR-195-5p/CDK6信號來參與肺鱗癌進展[19]。有研究發現,lncRNA CASC9能通過調控miR-335-3p/miR-195-5信號促進胰腺癌細胞增殖和侵襲[20]。本研究結果顯示,lncRNA CASC9在肺腺癌患者胸腔積液中表達上調,且與患者臨床分期、分化程度有關,提示lncRNA CASC9在胸腔積液中的表達水平可在一定程度上反映肺腺癌的發生及進展。有學者通過檢測胸腔積液中lncRNA CASC9表達發現其診斷胸腔積液良惡性的AUC為0.794。本研究通過ROC曲線分析發現,lncRNA CASC9診斷肺腺癌的AUC為0.789,而lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯合診斷肺腺癌的AUC為0.878,高于單項指標診斷,提示lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯合應用對診斷肺腺癌具有較高的臨床價值。

綜上所述,lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9在肺腺癌患者胸腔積液表達均上調,且與肺腺癌患者臨床病理有關,二者聯合對肺腺癌具有較好的臨床診斷價值。但本研究尚有不足之處,一是樣本量較少,二是與肺腺癌關系相關調控機制尚不明確,后續將擴大樣本量,并對相關作用機制進行深入研究。