羅琳涓, 潘 菁, 厲超元, 蔣備戰(zhàn)

(1. 同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科,上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心,上海 200072; 2. 同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科,上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心,上海 200072)

牙髓再生是治療牙髓感染或牙髓壞死的一種新方法,其中血管再生可以恢復(fù)牙齒的營養(yǎng)供應(yīng),被認(rèn)為是功能性牙髓再生的關(guān)鍵[1]。可注射型富血小板纖維蛋白(injectable platelet-rich fibrin, iPRF)是第二代血小板濃縮制品富血小板纖維蛋白的新型衍生物,其三維纖維蛋白支架結(jié)構(gòu)中富含Ⅰ型膠原,一定程度上模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu),同時含有可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和分化行為的各種生長因子[2-3]。此外,iPRF還在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、抗菌和促進(jìn)成骨發(fā)生方面發(fā)揮作用[2,4-5],其液體形態(tài)便于臨床操作,可能是用于誘導(dǎo)牙髓再生的一種理想的支架材料。

但是目前iPRF成血管作用的相關(guān)研究較少,因此本研究利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)探究iPRF促進(jìn)血管生成的能力,為使用iPRF進(jìn)行再生性牙髓治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖DMEM不完全培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶、PBS緩沖液、CCK-8試劑盒(凱基,中國);胎牛血清(Gibco,美國);鈣黃綠素(Sigma,美國);Matrigel基質(zhì)膠、細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)板(Coring,美國);濾器(Millipore,日本);血管生成載玻片(ibidi,意大利);TRIzol細(xì)胞裂解液、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,日本);低溫離心機(Thermo,美國);倒置顯微鏡(Nikon,日本)。

1.2 可注射型富血小板纖維蛋白提取液(injectable platelet-rich fibrin extract, iPRFe)的制備

本實驗經(jīng)過同濟大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號: [2021]-DW-70),所有志愿者知情同意。根據(jù)已經(jīng)報道的實驗方案[6],抽取5名健康男性志愿者(年齡18-35歲,不吸煙,不喝酒,無血液系統(tǒng)疾病,近期沒有服用影響血液系統(tǒng)的藥物)10 mL靜脈血,在4 ℃條件下離心(離心半徑10 cm,700 r/min,3 min),吸取上層黃色液態(tài)物質(zhì)即為iPRF。參考課題組前期研究方案并進(jìn)行改良[7],將iPRF凍干并研磨成粉,每80 mg iPRF粉末用40 mL高糖DMEM不完全培養(yǎng)基浸提24 h。在細(xì)胞超凈臺中使用0.22 μm濾器過濾浸提液后得到iPRFe,保存于-20 ℃冰箱。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs從中國科學(xué)院細(xì)胞庫中獲得,常規(guī)培養(yǎng)液為添加了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM不完全培養(yǎng)基,置37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.4 CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力

將iPRFe用高糖DMEM不完全培養(yǎng)基稀釋,并添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素,使iPRFe的濃度分別為1.6 mg/mL、0.8 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL。實驗分為5組,對照組為常規(guī)培養(yǎng)液,實驗組分別另外添加上述4種不同濃度的iPRFe,每組設(shè)置5個復(fù)孔。將HUVECs以2×103個/孔接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后更換為條件培養(yǎng)液,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于第1、3、5 d棄去原培養(yǎng)液,加入含有10% CCK-8液的100 μL高糖DMEM不完全培養(yǎng)基避光孵育1 h,用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A450)。

1.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

實驗分為2組,對照組培養(yǎng)液為含有1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM不完全培養(yǎng)基,實驗組另外添加最佳濃度的iPRFe,兩組培養(yǎng)液均不含胎牛血清,每組3個復(fù)孔。將HUVECs以1×105個/mL接種于6孔板,待細(xì)胞完全融合后,用無菌槍頭在孔板底部做出劃痕標(biāo)記,各組更換為無血清條件培養(yǎng)液,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、12、24 h在顯微鏡下拍照,用Image J軟件處理圖像,比較各組劃痕愈合情況。

1.6 小管形成實驗檢測細(xì)胞成血管能力

實驗分組同1.5。血管生成載玻片每孔加入10 μL復(fù)溫可流動的Matrigel基質(zhì)膠于底部,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中30 min使其凝固。調(diào)整HUVECs密度為2×105個/mL,每孔加入經(jīng)無血清條件培養(yǎng)液重懸的50 μL細(xì)胞懸液于基質(zhì)膠表面,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。6 h后,棄去原培養(yǎng)液,每孔加入50 μL濃度為6.25 μg/mL的鈣黃綠素,避光孵育30 min,PBS洗3次后熒光顯微鏡下拍照,用Image J軟件分析各組小管形成情況。

1.7 實時定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測成血管相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

實驗分組同1.5。將HUVECs以1×105個/mL接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后更換為無血清條件培養(yǎng)液。分別于12、24 h棄去原培養(yǎng)液,PBS洗3次,每孔加入1 mL TRIzol裂解細(xì)胞,根據(jù)試劑盒的說明書提取總RNA,再使用TaKaRa試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,檢測血管生成素(angiogenin, ANG),C-X-C基序趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4),血小板衍生生長因子受體A(platelet-derived growth factor receptor A, PDGFRA)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA的表達(dá)水平,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參基因。所用引物序列見表1。

表1 用于RT-qPCR的引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 iPRFe對HUVECs增殖能力的影響

用不同濃度的iPRFe處理HUVECs 12 h后發(fā)現(xiàn),0.4 mg/mL濃度的iPRFe促進(jìn)細(xì)胞增殖效果最佳,0.2 mg/mL濃度的iPRFe也有一定促進(jìn)作用(圖1A,P<0.05)。24 h后,所有濃度的iPRFe對HUVECs增殖能力均有促進(jìn)作用,其中0.4 mg/mL iPRFe組細(xì)胞增殖率高于1.6 mg/mL iPRFe組和0.2 mg/mL iPRFe組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B,P<0.05)。因此,0.4 mg/mL濃度的iPRFe被認(rèn)為是促進(jìn)HUVECs增殖的最佳濃度,并被選擇用于后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度iPRFe處理12 h(A)和24 h(B)后對HUVECs增殖能力的影響

2.2 iPRFe對HUVECs遷移能力的影響

用最佳濃度的iPRFe處理HUVECs,觀察細(xì)胞遷移情況。如圖2所示,培養(yǎng)12 h時,iPRFe組的細(xì)胞遷移率均大于對照組,24 h時差異更為顯著,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2,P<0.05)。

圖2 iPRFe對HUVECs遷移能力的影響

2.3 iPRFe對HUVECs成血管能力的影響

小管形成實驗的結(jié)果顯示,HUVECs經(jīng)iPRFe處理6 h后形成小管結(jié)構(gòu)的連接點數(shù)、分支數(shù)、總長度和相對面積均大于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3,P<0.05)。同時,iPRFe處理12 h和24 h也明顯提高了HUVECs中成血管相關(guān)基因ANG、CXCR4、PDGFRA和VEGF的表達(dá)水平(圖4,P<0.05)。

圖3 iPRFe對HUVECs成血管能力的影響

圖4 iPRFe處理12 h(A)和24 h(B)后對HUVECs成血管相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

牙髓再生包括干細(xì)胞移植策略和細(xì)胞歸巢策略,相較于前者,細(xì)胞歸巢策略不需要在體外培養(yǎng)干細(xì)胞,也避免了可能的免疫排斥反應(yīng),因此在臨床應(yīng)用上更具優(yōu)勢,但尋找合適的支架材料和生長因子提高牙髓再生的成功率是需要解決的問題[8-9]。血小板濃縮制品是一類天然生物支架材料,其交聯(lián)纖維蛋白網(wǎng)中含有促進(jìn)干細(xì)胞增殖、遷移和分化的生長因子,高濃度的血小板也在傷口愈合過程中充當(dāng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,已經(jīng)被用于促進(jìn)口腔軟、硬組織再生[10]。其中iPRF是靜脈血經(jīng)低速、低溫離心后得到的新型血小板濃縮制品,其液體形態(tài)的優(yōu)勢便于被注射入復(fù)雜細(xì)小的根管系統(tǒng),并在室溫下逐漸凝固,為再生醫(yī)學(xué)提供了一種實用形式[11]。

血管生成是胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)和組織再生等生理、病理過程中的重要事件[12]。牙髓是高度血管化的組織,因此血管再生是恢復(fù)牙齒活力,維持牙齒正常發(fā)育、免疫防御和自我修復(fù)功能的基礎(chǔ)[1]。體內(nèi)牙髓再生過程中血管化的發(fā)生可以由具有成血管潛能的牙源性干細(xì)胞直接實現(xiàn),也可以是牙源性干細(xì)胞在生長因子的誘導(dǎo)下分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,再發(fā)生增殖、遷移和成血管等一系列程序性事件[13-14]。本實驗選用的HUVECs源自人臍靜脈內(nèi)皮,可以較好模擬生理狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的特性,常被用于構(gòu)建體外成血管模型[12]。因此,本研究擬通過細(xì)胞增殖、遷移和成血管分化實驗分析iPRF對體外培養(yǎng)的HUVECs生物學(xué)行為的影響,初步評估iPRF在再生性牙髓治療中的應(yīng)用前景。

以往的研究提出,血小板濃縮制品對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并不完全表現(xiàn)為濃度依賴性[15]。同時,課題組前期在研究iPRF對人根尖牙乳頭干細(xì)胞(human stem cells from apical papilla, hSCAPs)生物學(xué)行為的影響時也發(fā)現(xiàn)0.4 mg/mL的iPRFe促進(jìn)hSCAPs增殖效果最佳,0.4 mg/mL的iPRFe還能明顯提高h(yuǎn)SCAPs的遷移和礦化能力[7]。因此,本研究參考前期研究方案并進(jìn)行改良,設(shè)置了1.6 mg/mL、0.8 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL共4個濃度梯度用于篩選促進(jìn)HUVECs增殖的最佳濃度。綜合分析12 h和24 h之后各組細(xì)胞的增殖情況后,0.4 mg/mL濃度的iPRFe被認(rèn)為是促進(jìn)HUVECs增殖的最佳濃度。iPRFe中被檢測到許多與細(xì)胞增殖、遷移和分化有關(guān)的生長因子[6,16],本實驗結(jié)果提示適宜濃度的生長因子對細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果最佳,過高的濃度反而達(dá)不到最好的效果。內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移是血管生成的標(biāo)志行為之一,參與血管生成的早期過程[12]。劃痕實驗常用于量度細(xì)胞橫向2D遷移的能力,體外培養(yǎng)的細(xì)胞完全融合后,在無血清的條件下人為制造的劃痕愈合情況可以反映細(xì)胞的遷移活性。在本研究中,劃痕制造12 h后iPRFe組細(xì)胞遷移率明顯大于對照組,24 h后兩組差異更為明顯,證明iPRFe可以有效促進(jìn)HUVECs的遷移能力。然而,既定的細(xì)胞行為可能是多種細(xì)胞因子和信號通路相互作用的結(jié)果,其作用機制有待進(jìn)一步研究。

本研究通過小管形成實驗和成血管相關(guān)基因的檢測來探究iPRFe對HUVECs成血管的作用。本實驗使用的Matrigel基質(zhì)膠是最簡單常用的體外血管生成模型,可以評估細(xì)胞在無血清條件下與基質(zhì)膠中的生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用而形成小管樣結(jié)構(gòu)的能力[17]。熒光圖片清晰展示了iPRFe組形成的小管樣結(jié)構(gòu)明顯多于對照組,與軟件定量分析結(jié)果一致。同時,iPRFe也顯著提高HUVECs中成血管相關(guān)基因ANG、CXCR4、PDGFRA和VEGF的mRNA表達(dá)水平。CXCR4參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),在血管生成早期招募細(xì)胞有助于血管再生[18];ANG、PDGFRA和VEGF通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的系列反應(yīng)刺激血管生成[19-21]。這些血管生成標(biāo)志物在iPRFe組的高表達(dá)也證明了iPRF的促血管生成能力。據(jù)報道,iPRF內(nèi)含有可以調(diào)節(jié)血管生成的多種生長因子,包括高濃度的血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)和VEGF等,可以緩慢釋放長達(dá)10 d以上[6,16]。以往的一項體外共培養(yǎng)模型也發(fā)現(xiàn),iPRF可以上調(diào)促血管生成因子VEGF的表達(dá)[22]。iPRF聯(lián)合明膠納米顆粒也被報道可以促進(jìn)血管生成和成骨,有利于拔牙后的牙槽嵴保存[23]。總的來說,iPRF在促進(jìn)血管生成的多個事件中都發(fā)揮了促進(jìn)作用,其促血管生成和組織再生的能力得到初步驗證。然而,本研究還有很大的局限性,因為HUVECs不存在于生理狀態(tài)下的牙髓組織中,不能完全代表牙髓再生過程中干細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此,基于本研究的結(jié)論,本課題組計劃進(jìn)一步探究iPRF對牙髓內(nèi)固有細(xì)胞成血管分化能力的影響,更好地闡明iPRF用于臨床牙髓再生的可行性。

綜上所述,本研究結(jié)果表明iPRF對體外培養(yǎng)的HUVECs增殖、遷移和成血管分化能力具有促進(jìn)作用,為可注射型富血小板纖維蛋白應(yīng)用于再生性牙髓治療提供了一定理論基礎(chǔ),但其分子機制及臨床轉(zhuǎn)化的效果有待進(jìn)一步探究。