槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡抑制作用研究

游鎮(zhèn)君，蔣毅，吳可沁，季斌，胡安全，蔣侃凌

槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡抑制作用研究

游鎮(zhèn)君，蔣毅，吳可沁，季斌，胡安全，蔣侃凌

浙江省嘉興市第一醫(yī)院骨科，浙江嘉興 314000

探討槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的抑制作用。采用鈦顆粒處理小鼠MC3T3-E1細(xì)胞系構(gòu)建細(xì)胞凋亡模型，應(yīng)用槲皮素進(jìn)行干預(yù)并設(shè)置對照，噻唑藍(lán)法[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT法]法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）檢測白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)，免疫熒光技術(shù)檢測C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、B細(xì)胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白的表達(dá)，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測CHOP和Bcl-2的mRNA的表達(dá)。鈦顆粒抑制成骨細(xì)胞增殖活性，并呈濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，鈦顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。槲皮素預(yù)培養(yǎng)能有效緩解鈦顆粒對成骨細(xì)胞增殖活性的抑制，減少其凋亡。ELISA檢測結(jié)果顯示，槲皮素能減少IL-1β和TNF-α表達(dá)。免疫熒光技術(shù)顯示槲皮素參與調(diào)控CHOP蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，槲皮素參與調(diào)控CHOP和Bcl-2的mRNA的表達(dá)。槲皮素能抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動的凋亡途徑抑制，調(diào)控CHOP、Bcl-2蛋白表達(dá)的信號通路有關(guān)。

槲皮素；成骨細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；鈦顆粒

磨損顆粒碎屑所誘導(dǎo)的骨溶解和骨吸收是造成人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動的主要原因[1]。目前，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動尚無有效的預(yù)防和治療方法。如能用藥物預(yù)防和治療人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動，不僅可延長人工關(guān)節(jié)假體的使用壽命、避免翻修手術(shù)，而且可為患者減輕痛苦和節(jié)約費用，具有巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。槲皮素及其衍生物是植物世界分布最廣的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗突變、抗血管形成、抑制組胺分泌等作用[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）啟動的凋亡途徑是近年來研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能抑制ERS凋亡途徑[3]。但是目前還沒有使用槲皮素對假體松動治療的研究報道。目前大多數(shù)研究在于磨損顆粒激活破骨細(xì)胞引起的骨溶解方面。然而作為假體周圍的主要細(xì)胞成分，成骨細(xì)胞也參與了無菌性松動的病理過程[4]。本實驗采用磨損鈦顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡作為模型，研究槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡抑制作用，并探索其可能的機(jī)制，為其應(yīng)用于假體周圍骨溶解及無菌性松動的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系購自上海安為生物科技有限公司。

1.1.2 藥物與試劑 1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液、胰蛋白酶均購自艾爾吉生物科技有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑- 2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，MTT]溶液、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海索萊寶生物科技有限公司；CHOP/GADD153多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）多克隆抗體、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）單克隆抗體均購自美國Proteintech公司；抗兔IgG(H+L)購自美國Cell Signaling Technology公司；Bcl-2、CHOP均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；鈦顆粒購自美國Thermo Scientific公司；槲皮素購自上海索萊寶生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；PCR引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter Life Sciences公司），正置熒光顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司），電泳儀（北京東方瑞利科技有限公司），7500定量實時PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 44.5ml MEM細(xì)胞培養(yǎng)基+5ml胎牛血清+0.5ml雙抗，混勻。把細(xì)胞凍存管從液氮罐中快速取出，放置于一次性手套中，隔絕恒溫水浴鍋中的水，快速搖晃，在2min之內(nèi)融化。取出一次性手套中的細(xì)胞凍存管，噴75%乙醇消毒后，放置在超凈工作臺中，用1ml移液器轉(zhuǎn)移凍存管中細(xì)胞到裝有培養(yǎng)基的15ml離心管，蓋上蓋子，用封口膜封口。用水平離心機(jī)4000r/min（離心半徑200mm），離心4min，離心結(jié)束后，15ml離心管外壁噴75%乙醇消毒后，放置于超凈工作臺中，棄去上清液，加入1ml新鮮培養(yǎng)基，吹勻，轉(zhuǎn)移至25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶。用顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)和密度，細(xì)胞圓潤透亮，密度適中為合適。把25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶噴75%乙醇消毒后，放置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)備用。

1.2.2 MTT檢測不同濃度的鈦顆粒、槲皮素對成骨細(xì)胞的作用 MC3T3-E1細(xì)胞鋪96孔板，每個孔鋪200μl含6×103個細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為3×104個/ml。鋪板貼壁24h，使用濃度為0、100、200、400、600、800μmol/L鈦顆粒和濃度為0、3、6、12、25、50μmol/L槲皮素分別處理MC3T3-E1細(xì)胞24h，按不同分組處理換α-MEN培養(yǎng)基，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)上清夜，每孔加入150μl DMSO，待結(jié)晶完全溶解后酶標(biāo)儀490nm處檢測吸光度值。細(xì)胞存活率（%）=（各實驗組吸光度值–調(diào)零孔吸光度值）/（對照組吸光度值–調(diào)零孔吸光度值）×100%。

1.2.3 MTT檢測槲皮素對磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的保護(hù)作用 MC3T3-E1細(xì)胞分別鋪96孔板，每個孔鋪200μl體系6×103個細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為3×104個/ml。鋪板貼壁24h，先使用槲皮素濃度為3、4、5、6μmol/L預(yù)處理細(xì)胞2h再加入600μmol/L鈦顆粒成骨細(xì)胞24h，MTT檢測細(xì)胞活性。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的IL-1β和TNF-α表達(dá) 使用5μmol/L的槲皮素預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞2h，用600μmol/L的鈦顆粒處理24h。ELISA檢測各組上清液中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，樣本孔中加入待測樣本50μl，空白孔不加，除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱孵育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加350μl洗滌液，靜置1min，甩去液體，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μl，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔吸光度（）值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡 MC3T3-E1細(xì)胞鋪100mm皿里，每個皿6000μl體系100×104個細(xì)胞懸液。鋪板貼壁24h，先使用槲皮素5μmol/L預(yù)處理細(xì)胞2h再加入上面600μmol/L鈦顆粒分別處理成骨細(xì)胞24h。細(xì)胞使用胰蛋白酶消化細(xì)胞離心，重懸，取100μl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5min，加入5μl的碘化丙錠溶液（propidium iodide，PI），并加400μl PBS，立刻進(jìn)行流式或熒光顯微鏡檢測。空白管：陰性對照組細(xì)胞，不加Annexin V/FITC，PI溶液，用于調(diào)節(jié)電壓。單染管：陽性對照組細(xì)胞，只加Annexin V/FITC，用于調(diào)節(jié)補償。檢測管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/FITC，PI溶液，用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

1.2.6 免疫熒光技術(shù)檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的CHOP、Bcl-2蛋白的表達(dá) MC3T3-E1細(xì)胞鋪爬片，MC3T3-E1細(xì)胞鋪20×104個細(xì)胞。鋪板貼壁24h，先使用槲皮素5μmoL/L預(yù)處理細(xì)胞2h再加入上面600μmol/L鈦顆粒處理MC3T3-E1細(xì)胞24h。24h后，將細(xì)胞爬片取出，用PBS洗1～2次，甲醇固定10～15min，用PBS洗3次，每次5min，甩干用免疫熒光筆畫圈。放搖床上用羊血清封閉液封閉60min。孵一抗和二抗用（TBST）Tris Buffered saline Tween稀釋，將稀釋好的一抗加滴加到爬片上，4℃孵育過夜。次日放搖床上PBS洗3次，每次5min，孵二抗90min，放搖床上PBS洗3次，每次5min，避光孵4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino- 2-phenylindole，DAPI) 3～5min。

1.2.7 RT-PCR檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的CHOP和Bcl-2mRNA的表達(dá)收集各組細(xì)胞，提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PCR試劑盒說明書配制PCR擴(kuò)增體系。將所獲得cDNA進(jìn)行定量定時PCR，擴(kuò)增條件：擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2min，95℃ 5s，56℃退火10s，60℃ 20s，共計40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后通過溶解曲線評價擴(kuò)增樣品的特異性與可靠性。GAPDH作為內(nèi)參照，采用2–△△Ct法計算目的基因mRNA的表達(dá)情況。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 鈦顆粒對成骨細(xì)胞活性的影響

鈦顆粒對成骨細(xì)胞的抑制濃度0、100、200、400、600、800μmol/L的鈦顆粒處理成骨細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率分別為96%、87%、76%、64%、49%、36%，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）。MC3T3-E1細(xì)胞在隨著鈦顆粒濃度增加時細(xì)胞平均存活率逐漸降低，鈦顆粒對MC3T3-E1細(xì)胞的生長有抑制作用，并且在鈦顆粒為600μmol/L時對細(xì)胞的抑制率接近50%，見圖1。

圖1 MTT法檢測鈦顆粒對成骨細(xì)胞存活率的影響

A.成骨細(xì)胞在不同濃度的鈦顆粒作用下值；B.成骨細(xì)胞在不同濃度的鈦顆粒作用下的存活率；與對照組比較，*<0.05，**<0.001

2.2 槲皮素干預(yù)對成骨細(xì)胞增殖活性的影響

MC3T3-E1細(xì)胞在槲皮素濃度為0、3、6、12、25、50μmol/L時細(xì)胞平均活率分別為99%、96%、93%、64%、48%、34%，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）。MC3T3-E1細(xì)胞在隨著槲皮素濃度逐漸升高時，細(xì)胞平均存活率呈遞減趨勢，只有在3～6μmoL/L時對細(xì)胞存活率無影響。高濃度的槲皮素對MC3T3-E1細(xì)胞的生長起到抑制作用，見圖2。

2.3 MTT法檢測槲皮素對磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的保護(hù)作用

MC3T3-E1細(xì)胞在濃度為3～5μmol/L槲皮素預(yù)處理2h下再加600μmol/L鈦顆粒作用24h的細(xì)胞平均存活率隨槲皮素濃度的增加而逐漸升高。在5μmol/L槲皮素處理下，MC3T3-E1細(xì)胞存活率最高為99%，說明在此濃度下的槲皮素對MC3T3-E1細(xì)胞能有一定的保護(hù)作用，見圖3。

2.4 ELISA檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的IL-1β和TNF-α表達(dá)水平

ELISA檢測結(jié)果顯示，MC3T3-E1細(xì)胞對照組、槲皮素組、鈦顆粒組、槲皮素+鈦顆粒組的IL-1β的表達(dá)水平分別為33.75、33.38、40.73、36.57pg/ml，經(jīng)鈦顆粒誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平升高，而加槲皮素預(yù)處理后再加鈦顆粒誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞的IL-1β的表達(dá)水平較鈦顆粒組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）。對照組、槲皮素組、鈦顆粒組、槲皮素+鈦顆粒組的MC3T3-E1細(xì)胞的TNF-α的表達(dá)水平分別為156.44、153.65、186.81、168.22pg/ml，經(jīng)鈦顆粒誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平升高，而加槲皮素預(yù)處理后再加鈦顆粒的組別TNF-α表達(dá)水平較鈦顆粒組明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05），見圖4。

圖2 MTT法檢測槲皮素對成骨細(xì)胞存活率的影響

A.成骨細(xì)胞在不同濃度的槲皮素作用下值；B.成骨細(xì)胞在不同濃度的槲皮素作用下的存活率；與對照組比較，*<0.001

圖3 MTT法檢測槲皮素與鈦顆粒聯(lián)合對成骨細(xì)胞存活率的影響

A.成骨細(xì)胞在各組槲皮素與鈦顆粒聯(lián)合作用下值；B.成骨細(xì)胞在各組槲皮素與鈦顆粒聯(lián)合作用下的存活率；與對照組比較，*<0.05，**<0.01

圖4 槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的IL-1β和TNF-α表達(dá)水平的影響

A.誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的IL-1β表達(dá)水平；B.誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的TNF-α表達(dá)水平；與對照組比較，*<0.05，**<0.01

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡

先用槲皮素預(yù)處理細(xì)胞2h，再加鈦顆粒作用24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率為3.30%，槲皮素組的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率為3.24%，鈦顆粒組的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率為43.14%，槲皮素+鈦顆粒組的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率為20.40%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）。鈦顆粒促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，槲皮素+鈦顆粒明顯降低了MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率，說明槲皮素對MC3T3-E1細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，見圖5。

2.6 免疫熒光技術(shù)檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的CHOP、Bcl-2的表達(dá)水平

CHOP在對照組和槲皮素組都有熒光表達(dá)，熒光主要是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且熒光強度弱，呈弱陽性表達(dá)。鈦顆粒組的CHOP在核質(zhì)都表達(dá)，熒光強度最強，呈強陽性表達(dá)。槲皮素+鈦顆粒組的CHOP表達(dá)位置在核質(zhì)，但主要是在質(zhì)中，熒光呈陽性表達(dá)。Bcl-2在對照組、槲皮素組和槲皮素+鈦顆粒組里熒光都呈弱陽性表達(dá)，在對照組表達(dá)位置主要是在細(xì)胞質(zhì)中，槲皮素組和槲皮素+鈦顆粒組里在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)都有表達(dá)。鈦顆粒處理的MC3T3-E1細(xì)胞的Bcl-2在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)都表達(dá)，呈強陽性表達(dá)，見圖6、圖7。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的影響

A.流式細(xì)胞圖；B.細(xì)胞凋亡率；與對照組比較，*<0.001

圖6 免疫熒光技術(shù)檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的CHOP表達(dá)

2.7 PCR檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的CHOP和Bcl-2的mRNA的表達(dá)

在成骨細(xì)胞中，相較于對照組，槲皮素誘導(dǎo)下CHOP的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但鈦顆粒組、槲皮素+磨損顆粒組中CHOP的mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）；槲皮素+磨損顆粒組的CHOP相對于鈦顆粒組蛋白表達(dá)有所降低。在成骨細(xì)胞中，相較于對照組，Bcl-2的mRNA在槲皮素、鈦顆粒、槲皮素+鈦顆粒誘導(dǎo)下升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）；槲皮素+磨損顆粒組的Bcl-2的mRNA相對于鈦顆粒組蛋白表達(dá)有所降低，見圖8。

圖7 免疫熒光技術(shù)檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于晚期關(guān)節(jié)炎的終極治療方法，可以有效地減輕患者的疼痛癥狀，恢復(fù)關(guān)節(jié)活動度，并讓患者早期回歸到正常的生活當(dāng)中。然而，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的廣泛應(yīng)用使得外科醫(yī)生又面臨一種新的挑戰(zhàn)，即如何應(yīng)對假體周圍骨溶解所引起的假體無菌性松動。目前很少有研究將重點放在假體周圍骨溶解中成骨細(xì)胞增殖活性受抑制和成骨細(xì)胞凋亡的環(huán)節(jié)上，對于上述環(huán)節(jié)具有保護(hù)作用的藥物及其機(jī)制的報道并不多。因此，理論上能有特效藥物解決長期困擾關(guān)節(jié)外科磨損顆粒導(dǎo)致的人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解與假體松動的頑疾，必將為人工關(guān)節(jié)置換患者帶來福音。近年來，有在實驗中觀察到磨損微粒對成骨細(xì)胞的抑制作用，本實驗研究結(jié)果與其相符[5]。鈦合金是目前骨科常用的假體材料，雖然其價格相對其他材質(zhì)較貴，但鈦合金具有良好的組織相容性且無明顯的不良反應(yīng)，其缺點是耐磨性差，因此，在假體周圍組織中鈦顆粒的含量也相對較高，本實驗選用純鈦顆粒作為磨損顆粒，主要原因是鈦的純度和顆粒大小都能符合實驗要求[6]。槲皮素及其衍生物已被作為天然抗氧化劑用于心血管疾病、骨質(zhì)疏松性疾病、腫瘤和糖尿病等方面的治療[7]。國內(nèi)外對其研究日益增多，槲皮素具有抗過敏、抗炎癥、抗氧化、抗病毒等作用[8-9]。研究證實，槲皮素能緩解甲基乙二醛誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)控阻斷Wnt通路，影響成骨細(xì)胞增殖分化有關(guān)[10]。但是目前還沒有使用槲皮素對假體磨損松動治療的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，鈦顆粒引起的成骨細(xì)胞增殖活性下降及細(xì)胞凋亡率的增高，而槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用。

圖8 PCR檢測槲皮素對鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞CHOP和Bcl-2的mRNA表達(dá)

A.誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞CHOP的mRNA表達(dá)情況；B.誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞Bcl-2的mRNA表達(dá)情況；與對照組比較，*<0.05，**<0.01，***<0.001

磨損顆粒導(dǎo)致的假體周圍骨溶解及假體松動的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程。關(guān)節(jié)活動產(chǎn)生的磨損顆粒會刺激局部組織產(chǎn)生無菌性炎癥，在假體周圍形成界膜組織，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞增生、浸潤并釋放大量的炎癥因子，進(jìn)而產(chǎn)生更多的炎癥細(xì)胞浸潤，同時也活化破骨細(xì)胞，引發(fā)局部發(fā)生骨溶解和骨吸收，最后導(dǎo)致假體松動。因此，TNF-α是磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的發(fā)生過程中的關(guān)鍵因子，其能直接與破骨前提細(xì)胞表面的腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成和活化；同時TNF-α還能促進(jìn)其自身以及IL-1β的生成[11]。因此，通過各種方法抑制TNF-α的水平，以及被認(rèn)為是治療磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍溶解的有效方法之一[12]。通過槲皮素的抗炎癥、抗氧化等功能，本實驗證實了槲皮素能抑制TNF-α和IL-1β水平，能顯著抑制炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展，抑制磨損顆粒導(dǎo)致的骨溶解的作用，具有高效、特異等顯著的優(yōu)勢。

研究表明，磨損顆粒誘導(dǎo)的慢性炎癥與細(xì)胞凋亡存在一定的關(guān)系[12]。細(xì)胞凋亡又稱作細(xì)胞程序性死亡，細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素的作用后，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的傳遞而激活凋亡基因。其中Wnt/β-Catenin、調(diào)控核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信號通路，Bcl-2家族蛋白表達(dá)以及逆轉(zhuǎn)表觀遺傳學(xué)修飾等途徑在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用[13-14]。細(xì)胞凋亡過程中沒有溶酶體和包膜破裂，內(nèi)涵物不外泄，不引起炎癥反應(yīng)及繼發(fā)性損害，可有效限制炎癥保護(hù)機(jī)體。但當(dāng)嚴(yán)重?fù)p害時，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生極度紊亂，細(xì)胞凋亡出現(xiàn)嚴(yán)重異常，可引起凋亡過快，凋亡比例過多或清除障礙，進(jìn)而產(chǎn)生機(jī)體組織炎癥損害。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡與磨損顆粒種類有關(guān)，在含金屬顆粒的介膜組織中細(xì)胞凋亡率最高，其次為超高分子聚乙烯顆粒及陶瓷顆粒[15]。因此，本實驗選擇鈦顆粒金屬作為磨損顆粒具有代表性，保證了實驗的齊同性和有效性。死亡受體活化和線粒體損傷途徑是細(xì)胞內(nèi)兩條經(jīng)典的凋亡途徑[16]。而ERS啟動的細(xì)胞凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要細(xì)胞器。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到缺氧、饑餓、鈣代謝紊亂、自由基侵襲及藥物等應(yīng)激原的刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白增多或鈣失衡，可引發(fā)ERS，細(xì)胞對ERS會產(chǎn)生未疊蛋白反應(yīng)（unfoled protein response，UPR）來降低蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)、肌醇激酶1（inositol-requiring kinase1，IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor6，ATF6）[18]。當(dāng)應(yīng)激過強時，UPR可激活CHOP引起細(xì)胞的凋亡，發(fā)生不可逆的損傷。CHOP是ERS誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的關(guān)鍵信號分子，過表達(dá)CHOP能夠誘發(fā)細(xì)胞的凋亡[19]。國外也有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能抑制ERS凋亡途徑[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，鈦顆粒能夠抑制成骨細(xì)胞增殖活性，并且呈濃度依賴性。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，鈦顆粒能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。本研究免疫熒光技術(shù)和PCR檢測結(jié)果均顯示，相對于鈦顆粒組，槲皮素+磨損顆粒組的CHOP蛋白表達(dá)有所降低，說明ERS啟動途徑受到抑制。槲皮素在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均可抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的CHOP表達(dá)上調(diào)，保護(hù)成骨細(xì)胞免受ERS誘導(dǎo)的凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外界信號啟動ERS途徑，發(fā)生由ERS所介導(dǎo)的凋亡信號通路時，通過CHOP調(diào)控下游的凋亡信號，如Bcl-2家族蛋白等，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡[21]。因此，阻斷CHOP介導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡進(jìn)展將是治療的潛在靶點之一。Pang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用刺激骨形成蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮抗ERS的生物學(xué)效應(yīng)。本實驗觀察到調(diào)控細(xì)胞凋亡的CHOP及其下游促凋亡信號的活性明顯增高，導(dǎo)致系膜細(xì)胞凋亡率明顯增加，而給予槲皮素干預(yù)后系膜細(xì)胞ERS得到抑制，CHOP及其下游促凋亡信號明顯減弱，細(xì)胞凋亡率明顯下降。因此，適量濃度槲皮素干預(yù)后顯著恢復(fù)了鈦顆粒抑制的成骨細(xì)胞增殖活性，本實驗證實，濃度5μmol/L槲皮素對成骨細(xì)胞有很好的保護(hù)作用。因此，適當(dāng)濃度的槲皮素可促進(jìn)成骨的活性，可能有利于假體與骨的牢固整合及長期穩(wěn)定。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，適量濃度槲皮素能抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動的凋亡途徑抑制，調(diào)控CHOP、Bcl-2蛋白表達(dá)的信號通路有關(guān)。但本研究為單純體外實驗，需進(jìn)一步研究證實，從而為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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Inhibitory effect of quercetin on titanium particles induced apoptosis in osteoblasts

Department of Orthopedics, the First Hospital of Jiaxing in Zhejiang Province, Jiaxing 314000, Zhejiang, China

To explore the inhibitory effect of quercetin on titanium particles induced apoptosis in osteoblasts.Mouse MC3T3-E1 cell line was treated with titanium particles to construct apoptosis model, quercetin was applied to intervene and control group was set up. Cell proliferation activity was detected by 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide assays (MTT), the apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by enzyme-linked immunoadsordent assay (ELISA). Immunofluorescence technology was used to detect the expression of C/EBP homologous protein (CHOP) and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) protein.The protein expression levels of CHOP and Bcl-2 mRNA expression were detected by real-time polymerase chain reaction(RT-PCR).Titanium particlesl inhibited osteoblast proliferation in a dose dependent manner. Flow cytometric showed that titanium particles induced osteoblast apoptosis. Quercetin pre-culture can effectively relieve the inhibition of titanium particles on the proliferation of osteoblasts and reduce their apoptosis. ELISA results showed that quercetin could reduce the expression of IL-1β and TNF-α. Immunofluorescence technology showed that quercetin is involved in regulating the expression of CHOP and Bcl-2 proteins, and RT-PCR detection results showed that quercetin is involved in regulating the mRNA expression of CHOP and Bcl-2.Quercetin can inhibit the apoptosis of osteoblasts induced by titanium particles, and which may be related to the inhibition of apoptosis pathway initiated by endoplasmic reticulum stress and the signal pathway that regulates the expression of CHOP and Bcl-2 protein.

Quercetin; Osteoblasts; Apoptosis; Titanium particles

R332

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.29.011

浙江省嘉興市科技計劃項目（2020AD30076）

蔣毅，電子信箱：jiangyi0573@163.com

（2023–03–26）

（2023–09–14）