KLHL7基因在胃癌中的表達及與胃癌臨床病理特征的關(guān)系分析*

安 霞,高夏青,楊春婷,王梓年,王宏偉,李海龍△

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,甘肅蘭州 730000;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000;3.蘭州市第一人民醫(yī)院腫瘤科,甘肅蘭州 730000

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一,也是全球常見癌癥相關(guān)死亡原因排第二位的惡性腫瘤。目前胃癌的治療手段主要是手術(shù)切除,但絕大多數(shù)胃癌在確診時已屬于進展期,已失去通過手術(shù)根治的機會。因此,研究早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物意義重大。KLHL7是Kelch樣家族蛋白成員之一,主要編碼BTB-Kelch相關(guān)蛋白,所編碼的蛋白質(zhì)可能參與蛋白質(zhì)降解。有研究發(fā)現(xiàn),KLHL7基因高表達于肺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中[1],其異常表達參與了部分腫瘤的惡性表型形成,而關(guān)于該基因在胃癌中的表達及臨床意義目前鮮見報道。本文擬借助數(shù)據(jù)庫對KLHL7在胃癌中組織中的表達情況、預(yù)后參數(shù)及其相關(guān)信號通路等進行生物信息學(xué)分析。

1 資料與方法

1.1KLHL7基因在人胃癌組織及癌旁組織中的表達 選擇在線仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫(https://www.xiantao.love/)檢索分析KLHL7基因在人胃癌組織及癌旁組織中的差異表達情況。仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫所用數(shù)據(jù)是經(jīng)癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)統(tǒng)一處理的腫瘤基因組圖譜(TCGA)和基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫(GTEx)的TPM(transcripts per million reads)格式的高通量測序數(shù)據(jù)。本研究所分析的數(shù)據(jù)均提取自TCGA中的胃癌組織和GTEx中對應(yīng)的癌旁組織或非配對正常組織數(shù)據(jù)。所有RNA測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)均以TPM格式表示,并進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后進行樣本間的KLHL7的差異表達比較。非配對組織樣本數(shù)據(jù)選擇仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫中來自TCGA數(shù)據(jù)庫414例胃癌樣本,210例非配對胃黏膜組織;胃癌表達數(shù)據(jù)來源于經(jīng)UCSC XENA統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的FPKM(fragments per kilobase per million reads)格式的高通量測序數(shù)據(jù)。非配對正常胃黏膜組織提取自TCGA和GTEx中胃癌組織對應(yīng)的正常組織數(shù)據(jù)。配對組織樣本數(shù)據(jù)選擇仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫中來自TCGA數(shù)據(jù)庫的27例胃癌樣本和癌旁組織樣本,于TCGA數(shù)據(jù)庫 (https://portal.gdc.cancer.gov/)下載并整理TCGA-胃腺癌(TCGA-STAD)項目STAR流程的RNA-seq數(shù)據(jù),并提取TPM格式的數(shù)據(jù)。

1.2KLHL7基因在人胃癌組織異常表達的臨床病理特征分析 利用仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫分析KLHL7基因在配對胃癌組織與癌旁組織中的表達情況、KLHL7基因異常表達的胃癌組織的TNM分期、組織學(xué)類型,并對KLHL7的異常表達開展免疫細胞浸潤特征分析和受試者工作特征(ROC)曲線分析。

1.3與KLHL7基因具有相關(guān)性的共表達基因進行京都基因和基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析 使用cBioPortal在線軟件 (https://www.cbioportal.org/)[2]檢索基于TCGA數(shù)據(jù)庫的412例胃癌與癌旁組織樣本的數(shù)據(jù)集,檢索其“co-expression”模塊中與KLHL7基因具有相關(guān)性的共表達基因。剔除相關(guān)系數(shù)<0.30的基因,并分別將剩余的上調(diào)和下調(diào)的共表達基因全部輸入Sanger學(xué)術(shù)平臺(http://vip.sangerbox.com/index.html)[3],運用KEGG一鍵化富集分析工具進行KEGG信號通路富集分析。

1.4相關(guān)共表達基因的蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析和核心基因篩選 選擇在線STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫[4],將有93個與KLHL7具有相關(guān)性的腫瘤基因輸入在線軟件STRING進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,采用K-means聚類算法,以n=3進行聚類分析。觀察并分析節(jié)點后,將節(jié)點(node)和周邊(edge)數(shù)據(jù)提取后導(dǎo)出文件。將PPI數(shù)據(jù)庫構(gòu)建作用靶點輸入Cytoscape 3.9 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),采用其插件CytoNCA計算參數(shù),篩選關(guān)鍵核心基因。進一步使用在線仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫驗證核心基因在胃癌與癌旁組織間的差異表達。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 如果組間數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性,則選用t檢驗;如果滿足正態(tài)分布,而不滿足方差齊性,則選用Welcht′檢驗;如果組間數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布,則選用非參數(shù)檢驗Wilcoxon秩和檢驗,信號通路富集分析使用R軟件包cluster Profiler(version 3.14.3)進行富集分析,KEGG信號通路富集分析中,選擇Benjamini-Hochberg法錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.1及P<0.05的信號通路為篩選標(biāo)準(zhǔn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1KLHL7基因在人胃癌組織及癌旁組織中的表達 在線仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫檢索KLHL7基因,分析結(jié)果表明,相對于癌旁組織,KLHL7基因在人胃癌組織中表達上調(diào)(P<0.001),見圖1;在非配對組織中,KLHL7基因在人胃癌組織的表達也高于正常組織(P<0.05),見圖2。其中,圖中縱坐標(biāo)是FPKM格式的高通量測序數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后顯示的基因表達量。

注:***P<0.001。圖1 KLHL7在配對胃癌組織及癌旁組織的表達

注:*P<0.05。圖2 KLHL7在非配對胃癌組織及癌旁組織的表達

2.2KLHL7基因在人胃癌組織異常表達的臨床病理特征分析 基于仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫對高表達KLHL7基因胃癌患者的臨床病理特征進行分析,結(jié)果表明,相對于正常組織,KLHL7基因在M0和M1期胃癌組織中表達水平升高(P<0.05),見圖3;相對于正常組織,KLHL7基因在胃癌組織中N0、N1、N2和N3期淋巴結(jié)中表達水平升高(P<0.05),見圖4;相對于正常組織,KLHL7基因在腫瘤分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的胃癌組織中表達水平升高(P<0.05),見圖5。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),KLHL7基因診斷胃癌的曲線下面積(AUC)為0.722(95%CI:0.606～0.837),提示其對胃癌具有潛在診斷價值。對免疫浸潤特征進行分析發(fā)現(xiàn),KLHL7基因高表達與中央記憶型T細胞(Tcm)和輔助性T細胞(Th細胞)浸潤呈正相關(guān),與漿細胞樣樹突狀細胞(pDC細胞)和Th17細胞浸潤呈負相關(guān),表明其與T細胞免疫和抗原呈遞有關(guān),見圖6。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖4 KLHL7在N0、N1、N2和N3淋巴結(jié)中的表達

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖5 KLHL7在不同STAGE期胃癌組織中的表達

注:Tcm為中央記憶型T細胞;T helper cells為輔助性T細胞(Th細胞);Tem為效應(yīng)記憶T細胞;NK cells為自然殺傷細胞;Tgd為gamma delta T細胞;Th2 cells為Th2細胞;Eosinophils為嗜酸性粒細胞;Th1 cells為Th1細胞;NK-CD56 bright cells為NK-CD56亮細胞;Macrophages為巨噬細胞;Mast cells為肥大細胞;TFH為濾泡輔助性T細胞;DC為樹突狀細胞;iDC未成熟的樹突狀細胞;aDC為活化的樹突狀細胞;Neutrophils為中性粒細胞;CD8 T cells為CD8 T細胞;T cells為T細胞;NK-CD56 dim cells為NK-CD56暗細胞;TReg為調(diào)節(jié)性T細胞;B cells為B細胞;Cytotoxic T cell為毒性T細胞;pDC為漿細胞樣樹突狀細胞;Th17 cells為Th17細胞。圖6 KLHL7在胃癌組織表達的免疫浸潤特征分析

2.3與KLHL7基因具有相關(guān)性的基因的信號通路富集分析 通過cBioPortal在線數(shù)據(jù)庫和Sanger學(xué)術(shù)平臺分析工具分析發(fā)現(xiàn),與KLHL7基因具有相關(guān)性的共表達基因有2 785個,包括上調(diào)的2 486個基因(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.30～0.63)和下調(diào)的299個基因(Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.47～-0.30)。這些基因富集在73個信號通路中,其中富集倍數(shù)>2為篩選標(biāo)準(zhǔn)的信號通路有33個,其中與腫瘤關(guān)系密切的有25個,分別是自噬、凋亡、細胞周期、慢性白血病、子宮內(nèi)膜癌、腫瘤壞死因子(TNF)、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)、結(jié)腸癌、Wnt等信號通路,見圖7。

注:圖中的信號通路依GeneRatio分?jǐn)?shù)自上而下依次為:癌癥通路、自噬、癌癥中的蛋白聚糖、HIF-1通路、細胞周期、結(jié)腸癌、凋亡、PI3K-Akt通路、TNF通路、子宮內(nèi)膜癌、環(huán)腺苷酸(cAMP)通路、非小細胞肺癌、膠質(zhì)瘤、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)通路、慢性白血病、細胞程序性死亡配體1(PD-L1)和細胞程序性死亡受體1(PD-1)檢查點通路、小細胞肺癌、前列腺癌、急性白血病、黑色素瘤、Wnt通路、白細胞介素(IL)-17通路、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)通路。圖7 與KLHL7具有相關(guān)性的共表達基因富集信號通路的氣泡圖

2.4共表達基因中核心基因篩選分析結(jié)果 共表達基因分析結(jié)果顯示,有93個基因富集在腫瘤密切相關(guān)的信號通路中;將其輸入在線軟件STRING進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,分析其節(jié)點,使用Cytoscape 3.8 軟件的CytoNCA插件計算參數(shù)篩選發(fā)現(xiàn),LYN、PPP1CB、NCF1、P4HB、GAK、BBS10、RPS6KA1、H2AFV、IFT88、CD68、NFKB1、SMC3、ARL13B、RAB23、CD74、MEAF6、HYDIN、GMPPB、SEC24C、RDX共20個基因為關(guān)鍵基因。經(jīng)GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫檢索,除P4HB、HYDIN、GMPPB和RDX 4個基因外,包括LYN、PPP1CB、NCF1、GAK、BBS10、RPS6KA1、H2AFV、IFT88、CD68、NFKB1、SMC3、ARL13B、RAB23、CD74、MEAF6、SEC24C的16個基因是胃癌組織與癌旁組織的差異表達基因,見圖8。在以上基因中,與KLHL7相關(guān)系數(shù)>0.5的基因為BBS10、PPP1CB、ARL13B和MEAF6(Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.508、0.529、0.535、0.538,均P<0.001)。另外,針對這4個基因,利用仙桃學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫分析其癌組織與癌旁組織之間的差異表達情況,結(jié)果顯示,BBS10、PPP1CB、ARL13B和MEAF6在胃癌組織中表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見圖9。

圖8 與KLHL7相關(guān)的共表達基因的核心基因篩選結(jié)果

3 討 論

KLHL7是Kelch樣家族蛋白的一員。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)42種KLHL成員分子,該家族蛋白成員在結(jié)構(gòu)上包含N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和中間的BACK結(jié)構(gòu)域,以及C端的6個Kelch重復(fù)序列。研究顯示,KLHL基因參與了DNA的損傷修復(fù)、凋亡、免疫反應(yīng)和維持骨骼肌結(jié)構(gòu)等多種生物學(xué)過程[5]。多項研究證明,KLHL的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)[6-9]。有研究指出,KLHL6在胃癌中高表達,下調(diào)KLHL6的表達能顯著降低MGC-803胃癌細胞集落形成、增殖和轉(zhuǎn)移,增強細胞凋亡[10]。KLHL19(KEAP1)的功能缺失可激活Nrf2,為胃癌細胞的生長提供有利條件[11]。在膽管癌中,敲低KLHL21的表達顯著降低膽管癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,誘發(fā)G0/G1期細胞阻滯,以及降低ERK1/2的磷酸化來阻礙ERK信號通路的激活[12]。KLHL37(ENC1)表達上調(diào)可增加結(jié)直腸癌和毛細胞白血病的風(fēng)險,且與卵巢癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[13-15]。以上研究提示,KLHLs家族的標(biāo)志物的異常表達在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中扮演著重要角色,有望作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

近年研究表明,KLHL7的突變與一些遺傳性疾病有關(guān)[16-19],但KLHL7在胃癌中的研究相對較少。KUROZUMI等[20]發(fā)現(xiàn),KLHL7在乳腺癌中的表達水平與組織學(xué)分級和分子亞型相關(guān),其高表達較低表達預(yù)后差。施瀟嫻[1]發(fā)現(xiàn),KLHL7在肺癌、胃癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌中高表達,沉默KLHL7可顯著抑制肺癌、胃癌和骨肉瘤細胞的增殖。本研究采用生物信息學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn),KLHL7在胃癌組織中高表達,其表達水平與TNM分期密切相關(guān),提示KLHL7可能是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要生物標(biāo)志物。免疫細胞浸潤分析發(fā)現(xiàn),胃癌中KLHL7高表達與Tcm和Th細胞浸潤呈正相關(guān),與pDC細胞和Th17細胞等細胞浸潤呈負相關(guān)。KEGG富集分析表明,KLHL7的相關(guān)基因主要富集自噬、凋亡、細胞周期、慢性白血病、子宮內(nèi)膜癌、TNF、HIF-1、結(jié)腸癌和Wnt等信號通路中。與腫瘤通路相關(guān)的16個核心基因在胃癌與癌旁組織中存在異常表達。由此推測,KLHL7在胃癌中的異常表達可能通過以上相關(guān)共表達基因和所富集的信號通路等促進胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

與KLHL7相關(guān)系數(shù)較高的共表達相關(guān)基因BBS10、PPP1CB、ARL13B和MEAF6在胃癌組織中表達均顯著高于癌旁組織。BBS10是Bardet-Biedl綜合征基因(BBS)基因家族的成員,BBS10作為分子伴侶,可能影響其他睫狀體或基底體蛋白的折疊或穩(wěn)定性。有研究指出,該基因在乳腺癌組織中是下調(diào)表達的熱休克蛋白亞型分子[21],而在胃癌中的表達和意義則鮮見研究。蛋白磷酸酶1催化亞單位β(PPP1CB)基因編碼蛋白磷酸酶1(PP1)的3個催化亞基之一,而PP1是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶,已知參與多種細胞過程的調(diào)節(jié),如細胞分裂、糖原代謝、肌肉收縮力、蛋白質(zhì)合成和人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)的轉(zhuǎn)錄。PPP1CB在胃癌中普遍表達,說明其在胃癌細胞生長中的起重要作用[22]。研究表明,PPP1CB基因與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。BADP核糖基化因子樣GTP酶13B(ARL13B)作為ADP核糖基化因子樣家族的一個成員,是一種小的GTP酶。體外和體內(nèi)實驗均表明,ARL13b可刺激胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[24]。在胃癌研究中,ARL13B的表達與腫瘤大小和侵襲深度密切相關(guān),ARL13B高表達的患者預(yù)后較差。MYST/Esa1相關(guān)因子6(MEAF6)為幾種不同組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組成部分,選擇性剪接導(dǎo)致多種轉(zhuǎn)錄變體。沉默MEAF6基因的表達可以抑制卵巢癌細胞的增殖[25]。通過構(gòu)建SDR16C5、MEAF6和SOX4 3個基因特征的結(jié)腸癌預(yù)測模型發(fā)現(xiàn),MEAF6在預(yù)測結(jié)腸癌的預(yù)后中顯示出較高的靈敏度和特異度,具有不同預(yù)后風(fēng)險的患者還表現(xiàn)出基因特征的差異表達、活化的CD4記憶T細胞浸潤,以及對比卡魯胺、吉非替尼、來那度胺和伊馬替尼的藥物敏感性[26],而該基因在胃癌中的表達和意義尚鮮見報道。以上研究提示,與KLHL7相關(guān)系數(shù)>0.5的共表達基因BBS10、PPP1CB、ARL13B和MEAF6可能參與腫瘤的生物學(xué)行為,值得進一步深入研究其在胃癌中的共表達意義。

綜上所述,本研究對胃癌組織中KLHL7表達和意義的分析結(jié)果表明,KLHL7是胃癌中高表達的癌基因,其表達與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),且與胃癌的免疫細胞浸潤和預(yù)后密切相關(guān),可作為胃癌診斷和預(yù)后評估的良好生物標(biāo)志物。