基于網絡藥理學及分子對接探討癃清片治療慢性前列腺炎的作用機制

金 悅 ,程義東 ,王安喜

(南京中醫藥大學附屬南京市中醫院,江蘇 南京 210000)

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis,CP)是男性常見疾病之一,多表現為下腹及會陰部疼痛、排尿及性功能異常,發病率高,病程長,在一定程度上影響患者的生活與精神狀態。流行病學顯示,我國有8.4%的男性患有前列腺炎癥狀,其中CP是最常見的類型[1]。除應用α受體阻滯劑、5-α還原酶抑制劑外[2-3],祖國醫學也展現出了獨特優勢。癃清片作為臨床上治療CP的常用藥物,在改善患者的疼痛及異常癥狀上療效較好。癃清片是以澤瀉、車前子、敗醬草、金銀花、牡丹皮、白花蛇舌草、赤芍、仙鶴草、黃連、黃柏十味中藥構成的復方,能夠清熱涼血、解毒通淋,適用于CP。動物實驗表明癃清片不僅具有良好的局部及中樞鎮痛效果,還能抑制小鼠體內的炎癥因子[4]。多項臨床應用也表明癃清片能改善CP患者臨床癥狀,提高患者生活質量,減輕患者精神壓力[5-6]。癃清片治療CP的具體機制尚未明確,本文擬通過網絡藥理學及分子對接對癃清片治療CP的潛在靶點進行預測,探討治療CP的作用機制,為未來相關研究及臨床應用帶來新視野。

1 材料與方法

1.1 癃清片中藥物活性成分及作用靶點

通過TCMSP數據庫[7],分別以癃清片中單味藥物為關鍵詞,以口服利用度(OB)≥30%及藥物相似性(DL)≥0.18為標準,篩選出藥物的活性成分及與之對應的潛在靶點,剔除重復數據后整理得到癃清片的潛在靶點。在UniProt數據庫中選擇“Reviewed”“Human”下載人類基因官方靶點名稱。利用R軟件進行匹配。

1.2 CP靶點的獲取

在GeneCards數據庫中以“Chronic prostatitis”為關鍵詞,檢索相應靶點。利用Perl腳本及R軟件,將獲取的癃清片藥物靶點與疾病靶點選取其中交集部分,得到Drug-Disease潛在靶點及官方基因名稱,繪制相應Veen圖。

1.3 構建PPI網絡

將潛在靶點導入STING數據庫,Organisms選擇“Homo sapiens”,最低互動得分設置為0.9,去除游離節點,構建相應PPI網絡。將潛在靶點的相互作用通過Cytosacpe軟件下載CytoNCA進行拓撲分析及可視化分析。

1.4 構建疾病-藥物-成分-靶點網絡圖

將Drug-Disease文件導入Perl腳本,獲取相應的作用關系,再通過Cytoscape軟件,構建疾病-藥物-成分-靶點網絡通路圖。

1.5 富集分析

運用R對Drug-Disease進行GO富集分析,選擇生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)前10項繪制柱狀圖,選擇KEGG前30條通路繪制柱狀圖,預測癃清片治療CP的潛在作用機制。

1.6 分子對接

選擇排名前10的核心靶點與相應的化合物,使用ChemDraw及Chem3D軟件構建3D結構,在PDB網站獲取每個靶點所對接靶蛋白及配體結構,通過AutoDock Tools、AutoDock Vina[8]進行分子對接,PyMoL軟件進行數據處理與可視化分析。

2 結果

2.1 癃清片中藥物活性成分及作用靶點

在TCMSP數據庫中,對癃清片中中藥篩選后共得到化合物158種,其中澤瀉10種、車前子9種、敗醬草13種、金銀花23種、牡丹皮11種、白花蛇舌草7種、赤芍29種、仙鶴草5種、黃連14種、黃柏37種,剔除重復成分,篩選出有效活性成分共118種。利用R軟件與進行人類基因官方靶點名稱匹配,剔除重復值后得到藥物靶點218個。

2.2 CP靶點的獲取

檢索到疾病靶點9116個,利用R得到藥物與疾病相交集的靶點204個(圖1)。

圖1 Drug-Disease靶點Veen圖

2.3 構建PPI網絡

利用STING數據庫構建PPI網絡(圖2)。將STING數據庫生成的文件導入Cytosacpe,篩選出33個滿足條件的靶點,進行可視化分析(圖3)。前10位的核心靶點CTNNB1、ESR1、JUN、AKT1、CAV1、EGFR、IL6、NCOA1、RELA、AR,推測其是癃清片在治療CP過程中發揮關鍵作用的靶點。

圖2 PPI網絡圖

圖3 以BC和Degree的中位數2倍值篩選出的核心靶點

2.4 構建疾病-藥物-成分-靶點網絡圖

利用Perl腳本及Drug-Disease靶點的相互作用關系,通過Cytoscape構建疾病-藥物-成分-靶點網絡通路(圖4)。網格中共有233個節點及435條邊,涉及27種活性成分和204個靶點。

圖4 疾病-藥物-成分-靶點網絡通路圖

2.5 富集分析

進行GO富集分析及KEGG通路分析(圖5、圖6)。GO富集中包括2452個BP、84個CC、197個MF,其中BP與CP相關主要為對活性氧應答、氧化應激反應、脂多糖反應、細胞對氧化應激的應答、對氧含量的應答、神經元凋亡等。CC主要為膜筏、膜微區、質膜小窩、質膜筏、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物等。MF主要為DNA-結合轉錄因子結合、RNA特異性聚合酶ⅡDNA-結合轉錄因子結合、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、G蛋白偶聯胺受體活性等。KEGG富集中包含信號通路174條,與CP相關的主要有IL-17 信號通路、C型凝集素受體信號通路、MAPK信號通路、Th17細胞分化、HIF-1 信號通路、細胞凋亡等。

圖5 GO富集分析

圖7 分子對接可視化分析

2.6 分子對接

除去少量無合適配體的蛋白(CAV1、IL6、RELA)外,各化合物與蛋白對接的最低結合能均<-1.2kcal/mol(表1),說明化合物與相應蛋白能自發結合,最低結合能越小說明結合作用越緊密。利用PyMol軟件進行可視化分析(圖8),可見關鍵靶標的氨基酸殘基與呈黃色虛線的氫鍵相互作用。

表1 分子對接結果

4 討論

CP在祖國傳統醫學里被稱為“精濁”,以盆腔、會陰、陰莖區及下腹部疼痛,排尿或射精時疼痛為主要臨床癥狀[9]。當前臨床方案主要改善臨床癥狀及抗感染,長時間、大劑量抗菌藥物應用易對人體產生耐藥性及不良反應。近年來,癃清片作為安全且有效的治療藥物被廣泛應用于CP的治療。

癃清片治療CP的主要活性成分為bolusanthol B、β-胡蘿卜素(beta-carotene)、槲皮素(quercetin)、高車前素(Dinatin)、Hypolaetin等。槲皮素具有抑制COX-2、巨噬細胞炎癥反應的作用,可減少炎癥細胞ROS的釋放,抑制氧化應激和細胞凋亡[10]。bolusanthol B是來源于敗醬草的黃酮類物質,王莉萍等通過提取白花敗醬總黃酮,經動物實驗后發現其有明顯抗氧化作用[11-12]。Hypolaetin是車前子治療CP的最可能發揮主要作用的化合物之一[13]。高車前素藥理活性主要表現在抗炎、抗氧化、神經保護等[14]。

在GO富集分析中,脂多糖可提高血清中炎癥因子的含量,導致炎癥的發生以及相應部位的疼痛。國外研究表明,大量活性氧(ROS)可通過引發細胞內信號級聯反應增強炎性基因表達[15]。氧化應激也是一種重要的病理機制,甚至導致細胞凋亡。也有研究證實免疫功能的強弱與機體的抗氧化水平有關,ROS含量過高會損傷自身免疫功能[16]。在KEGG通路方面,Th17是一種能夠分泌IL-17的CD4+T細胞,能夠招募及活化各種炎性細胞,誘導炎癥反應,與慢性炎癥的關系密切[17]。IL-17是重要的炎癥介質,不僅能刺激多種炎癥因子的產生,還可與其他細胞因子協同作用,進而加劇炎癥效應[18,19]。C型凝集素受體信號通路激活不僅可以誘導各種炎癥因子和趨化因子的表達,還能促進細胞產生促炎因子[20],MAPK信號通路能夠廣泛參與細胞的各項增殖、凋亡及應激反應,增加炎癥因子的表達[21]。HIF-1α缺氧條件下可大量合成并誘導血管通透因子VEGF的表達,進而促進內皮細胞的活化以誘導炎癥[22]。分子對接結果顯示蛋白的表達與文獻中報道的趨勢基本一致,癃清片治療CP是由于多成分、多靶點、多通路之間的復雜作用。

癃清片主要通過調節多種核心靶點,對活性氧應答、氧化應激反應等生物學過程及IL-17、MAPK、C型凝集素受體等信號通路治療CP。本文以網絡藥理學與分子對接為基礎,通過大量數據與文獻提升了對于疾病的認識,初步揭示了癃清片治療CP的作用機制,對今后疾病的診治提供了新的指導,但也存在一定的局限性。首先,由于部分靶點蛋白未能匹配相應配體,后續需針對相關成分及靶點蛋白進行進一步測試;其次,癃清片進入人體后吸收及代謝存在差異,囿于客觀條件及時間限制,未能結合試驗完成進一步驗證;最后,本文選取癃清片的主要成分及靶點,可能未涵蓋癃清片中10味中藥的全部有效活性成分,在今后的研究中仍可進一步探討。