神經酰胺在Ang Ⅱ致人臍靜脈內皮細胞凋亡中的作用*

尹 娜,沈珠甫,陳麗娟,康 丹,陳艷萍

(解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院老年醫學科,云南 昆明 650032)

細胞凋亡,又稱程序性死亡,是有核細胞在相關誘導因素作用下通過信號轉導途徑啟動胞內的一種死亡機制,是生物體的一種自穩機制[1],細胞凋亡最早由Kerr在1972年提出。細胞凋亡廣泛存在于心腦血管疾病、糖尿病、腎病、各種腫瘤等病理變化中[2-4]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)作為是機體的主要調節因子之一,發揮多種生物功能,如促進血管平滑肌收縮、刺激醛固酮分泌、促進內皮細胞凋亡等[5],而內皮細胞功能失調是許多心腦血管疾病發病的基礎,與多種心腦血管疾病的發生、發展密切關聯,故研究Ang Ⅱ誘導血管內皮細胞凋亡的調控機制有著重要的臨床意義,現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

參照Madan等[6]方法分離人臍靜脈內皮細胞,用含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養基在 37℃、5 % CO2培養箱中培養。神經酰胺(ceramide)購自某公司,用無水乙醇配制成50mmol/L儲備液-20℃保存。給藥時無水乙醇在細胞培養液中的體積分數≤0.1%,胎牛血清購自某公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 流式細胞儀檢測血管內皮細胞凋亡

將血管內皮細胞按1×104/mL接種于6孔培養板,在培養箱中過夜培養,待細胞貼壁后,對照組不加入Ang Ⅱ,Ang Ⅱ組各組終濃度分別為10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L,對照組及Ang Ⅱ各組24 h后PBS緩沖液(Phosphate Buffered Saline)洗滌細胞,加入0.25%胰酶消化,1000r/min轉速離心,加binding buffer重懸細胞,加入5uL Annexin V-FITC與1uLPI避光反應15mL,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.2 Ang Ⅱ誘導血管內皮細胞凋亡

采用終濃度為10-6mol/L的Ang Ⅱ分別處理血管內皮細胞6、24、48 h后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.3 神經酰胺合成酶抑制劑煙曲霉素B1(fumonisin B1,FB1)抑制 Ang Ⅱ誘導的血管內皮細胞凋亡

FB1預處理細胞24h后,再加入終濃度為10-6μmol/L的Ang Ⅱ處理 24h后與對照組血管內皮細胞凋亡情況相比較。

1.2.4 統計學分析

2 結果

2.1 Ang Ⅱ誘導血管內皮細胞凋亡

2.1.1 Ang Ⅱ呈劑量依賴性誘導內皮細胞凋亡

用終濃度分別為10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的Ang Ⅱ分別干預血管內皮細胞24 h后,根據流式細胞儀檢測結果,與對照組相比,Ang Ⅱ組細胞凋亡指數明顯增高,且隨Ang Ⅱ劑量的加大逐漸上升。P<0.05,見表1、圖 1。

圖1 不同濃度Ang Ⅱ誘導的調亡細胞率

表1 不同濃度 Ang Ⅱ 誘導的凋亡細胞率

2.1.2 Ang Ⅱ呈時間依賴性誘導內皮細胞凋亡

終濃度為10-6mol/L的Ang Ⅱ分別干預血管內皮細胞6 h、24 h 和 48 h后,隨干預時間的延長細胞凋亡指數逐漸升高,見表2、圖2。

圖2 不同時間Ang Ⅱ誘導的調亡細胞率

表2 不同時間 Ang Ⅱ 誘導的凋亡細胞率

2.2 FB1抑制Ang Ⅱ誘導的內皮細胞凋亡

Ang Ⅱ和Ang Ⅱ+FB1分別干預血管內皮細胞24 h后,根據流式細胞儀檢測結果,與對照組相比,Ang Ⅱ組凋亡指數明顯升高(P<0.05),Ang Ⅱ+FB1組細胞凋亡指數則無明顯變化。P>0.05,見表3、圖3。

圖3 各組間調亡細胞率

表3 內皮細胞凋亡指數在各組間的差異

3 討論

越來越多的證據揭示了Ang Ⅱ在心血管系統、腎臟、大腦等系統中的病理生理學作用,包括引起細胞表型改變、通過調節基因表達促進心肌細胞肥大、纖維化、炎癥、代謝功能障礙、衰老和細胞凋亡等[7]。Ang Ⅱ誘導細胞凋亡過程中主要的信號轉導途徑有神經酰胺信號系統、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fas)/配體(fatty acids ynthase ligand,FasL)信號系統、酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase,PTK)/絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1,MKP-1)信號系統[8]和蛋白激酶C信號系統[9]等。

神經酰胺作為鞘脂類的代謝產物,是構成細胞膜的主要磷脂之一,具有高度疏水性,對細胞穩態起重要作用,同時也是作為第二信使,對細胞的生長、增殖、分化、衰老、炎癥反應、細胞免疫等方面等起重要的調節作用,同時也介導了腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等應激因子及熱休克、紫外線照射、電離輻射、超氧自,TNF由基等誘導的細胞凋亡[10,11]。

血管內皮細胞凋亡導致其功能失調,血管內皮細胞功能失調是許多心血管病如冠心病、心力衰竭的發病基礎。本試驗結果表明Ang Ⅱ能誘導血管內皮細胞凋亡,且細胞凋亡率有濃度-效應關系。FB1能顯著抑制Ang Ⅱ誘導的內皮細胞凋亡,驗證了神經酰胺作為第二信使,可以介導Ang Ⅱ誘導的細胞凋亡,為進一步研究神經酰胺信號途徑在血管內皮細胞凋亡中的作用提供實驗依據。