豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重熒光定量PCR檢測方法的建立和初步應用

鄒 宏,夏應菊,李 玲,徐 璐,趙俊杰,王團結,張乾義*,宋振輝

(1.西南大學動物醫學院,重慶 402460;2.中國獸醫藥品監察所 國家/WOAH豬瘟參考實驗室,北京 100081)

當前,隨著豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)的使用,CSF得到有效控制[1],但近年來多地報道的慢性豬瘟和非典型瘟病毒流行,使防控形勢變得嚴峻復雜[2]。BVDV與CSFV同屬于黃病毒科瘟病毒屬[3],兩者核苷酸序列同源性約60%,彼此存在血清學交叉反應[4]。1973年[5]首次證實BVDV可自然感染豬[5],且實驗室診斷中常能檢測到BVDV抗體。此外,商品化胎牛血清及用于疫苗生產的細胞系中也有BVDV污染的報道[6]。豬瘟疫苗在生產過程中利用牛源血清增殖病毒,一旦血清中含有BVDV,就容易造成豬瘟疫苗中BVDV污染,進而感染豬群,導致豬瘟疫苗免疫失敗,容易存在生物安全風險和疫病傳播隱患。

為加強CSFV和BVDV臨床病例的混合感染診斷、生物制品及相應原料BVDV的篩查,本研究基于快速、準確、敏感的RT-qPCR檢測方法,針對CSFVE2片段及BVDV 5′UTR片段設計引物和探針,建立了一種更加敏感的雙重RT-qPCR方法,旨在能更特異地的區分CSFV和BVDV,為這兩種病毒的分子生物學檢測、流行病學調查和監測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 毒株及臨床樣本

CSFV、BVDV、口蹄疫病毒(FMDV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環病毒2型病毒(PCV 2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流感病毒(SIV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬非典型瘟病毒(APPV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)的毒株及116份臨床病料均由中國獸醫藥品監察所保存 。

1.2 引物和探針的設計及合成

利用MEGA軟件對NCBI核酸數據庫中公布的BVDV 5′UTR、CSFVE2 基因序列進行比對,通過Primer 5軟件對每個病原分別設計引物和探針。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重組陽性質粒模板的制備

根據核酸提取試劑盒以CSFV-C株、BVDV-NADL標準毒株為模板提取病毒RNA,反轉錄為cDNA,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收純化。將產物與pGEM-TEasy載體連接,轉化、菌液PCR鑒定為陽性后,進一步測序鑒定。通過核酸測定儀檢測質粒濃度,使用道爾頓計算法計算質粒拷貝數,ddH2O將質粒稀釋成1.0×100～1.0×109copies·μL-1后于-80 ℃保存備用。

1.4 RT-qPCR反應條件優化及標準曲線的建立

使用濃度為1×104copies·μL-1的兩種重組質粒混合后作為模板,對退火溫度、引物及探針濃度進行優化。以質粒濃度為1.0×107～1.0×102copies·μL-16個稀釋度的兩種重組質粒混合后作為模板,按優化好的反應條件進行RT-qPCR擴增建立標準曲線。

1.5 靈敏度試驗

取濃度為1.0×103～1.0×100copies·μL-1的兩種重組質粒混合后作為模板進行雙重RT-qPCR擴增;用1.0×107～1.0×100copies·μL-1的兩種重組質粒各自作為模板,進行普通PCR擴增,比較兩種擴增方法的靈敏度。

1.6 特異性試驗

分別以BVDV、CSFV、ASFV、APPV、FMDV、PPV、PRV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、JEV的病毒核酸作為樣本,采用上述優化好的方法進行RT-qPCR擴增,檢測該方法的特異性。

1.7 重復性試驗

分別取1.0×102、1.0×104、1.0×106copies·μL-1的兩種重組質粒混合后作為模板,按照建立的雙重RT-qPCR方法擴增,每個陽性質粒做3次重復,計算組內和組間的變異系數。

1.8 臨床樣品的檢測

利用建立的雙重RT-qPCR方法及現行的CSFV RT-qPCR檢測方法(GB/T 27540—2011)、BVDV RT-qPCR檢測方法(GB/T 18637—2018)分別對山西省豬場臨床樣品、CSFV石門株感染動物組織樣品、BVDV-NADL株共109份不同組織、全血及7份來自不同生產商的胎牛血清進行檢測,并比較二者之間的符合率。

2 結 果

2.1 CSFV、BVDV陽性質粒模板的制備及RT-qPCR檢測方法的建立

分別將CSFV-E2、BVDV-5′UTR克隆至pGEM-T載體構建重組質粒,PCR擴增后經瓊脂糖凝膠電泳驗證,目的條帶大小為1 100 bp(CSFV-E2)和385 bp(BVDV-5′UTR),測序結果顯示插入片段同源性均為100%。優化后的RT-qPCR反應體系為 25 μL,2×HyperProbe Mixture 12.5 μL,CSFV-E2-F1/CSFV-E2-R1/CSFV-E2-P1和BVDV-F1/

BVDV-R1各加1 μL,BVDV-P1 加0.5 μL,模板2 μL,ddH2O 5 μL。反應程序 95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s;58 ℃ 20 s,45個循環。

將濃度為1.0×101～ 1.0×106copies·μL-1的兩種重組質粒混合后作為模板進行雙重RT-qPCR擴增,繪制標準曲線,見圖1。結果顯示CSFV-E2 回歸方程式y=-3.636 8x+38.567,相關系數R2為0.998 6;BVDV-5′UTRy=-3.666 4x+37.476,相關系數 R2為 0.998 1。表明兩種重組質粒的拷貝數均與各自的Ct值有良好的線性關系。

A. 熒光定量PCR結果:1～6.1×106 ～1×101 copies·μL-1CSFV陽性質粒;7～12.1×106 ～1×101 copies·μL-1BVDV陽性質粒;B. CSFV和BVDV標準曲線A. Results of RT-PCR:1-6. 1×106 ～1×101 copies·μL-1 CSFV positive plasmids;7-12. 1×106 ～1×101 copies·μL-1 BVDV positive plasmids;B. CSFV and BVDV standard curves圖1 CSFV、BVDV標準曲線建立結果Fig.1 Results of CSFV and BVDV standard curve creation

2.2 敏感性試驗

將濃度為1.0×107～ 1.0×100copies·μL-1的混合質粒標準品為模板,進行普通PCR擴增;將濃度為1.0×103～1.0×100copies·μL-1的混合質粒標準品為模板進行雙重RT-qPCR擴增。結果表明,該方法檢測的最低拷貝數均為5 copies·μL-1;普通PCR擴增最低檢測極限均為103copies·μL-1。前者比后者更敏感,表明所建方法敏感性較高(圖2)。

A. CSFV熒光定量PCR敏感性試驗結果;B. CSFV普通PCR敏感性試驗結果;C. BVDV熒光定量PCR敏感性試驗結果;D. BVDV普通PCR敏感性試驗結果。M. Marker;1～8. 1×107 ～1×100 copies·μL-1;9. 陰性對照(-)A. CSFV real-time RT-PCR sensitivity test results; B. CSFV normal PCR sensitivity test results; C. BVDV real-time RT-PCR sensitivity test results; D. BVDV normal PCR sensitivity test results. M. marker; 1-8: 1×107 ～1×100 copies·μL-1; 9. Negative control (-)圖2 熒光定量PCR和普通PCR敏感性試驗結果Fig.2 Results of real-time RT-PCR and PCR sensitivity tests

2.3 特異性試驗

分別以BVDV、CSFV、ASFV、APPV、FMDV、PPV、PRV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、JEV的核酸為模板,用建立的雙重RT-qPCR 方法檢測,結果顯示僅CSFV、BVDV出現特異性擴增,其他病原均為陰性,表明本方法具有很好的特異性。

2.4 重復性試驗

以1.0×102、1.0×104、1.0×106copies·μL-1的兩種重組質粒混合后作為模板,進行組內和組間的重復性試驗。結果表明變異系數均小于2%,說明本方法具有很好的重復性。

2.5 臨床樣品檢測

本研究建立的雙重RT-qPCR方法對109份臨床樣品及7份商品化牛血清進行檢測,結果顯示,CSFV 陽性率為12.9%;BVDV 陽性率為6.0%,與BVDV(GB/T 18637—2018)、CSFV(GB/T 16551—2020)國家標準診斷技術檢測結果一致,符合率為100%,表明此次建立的方法可用于CSFV和BVDV流行病學調查。

3 討 論

此前,為鑒別CSFV和BVDV,梁洪等[7]建立了BVDV與CSFV雙重RT-PCR一步檢測法,縮短了檢測時間,減少了操作污染,張宏偉等[8]、韋雪華等[9]建立了CSFV與BVDV雙重RT-qPCR檢測方法,前者僅為定性檢測,后者對兩種疾病的檢測極限分別為36和100 copies·μL-1。較之相比,本研究建立的雙重RT-qPCR檢測方法最低檢測極限為5 copies·μL-1,具有很高的敏感性;對其他豬群常見病原及陰性對照均未出現特異性擴增,展現出良好的特異性,在CSFV、BVDV早期鑒別診斷中更具優勢。

豬群BVDV的感染原因尚不明確,Tao等[10]認為,早期豬群BVDV感染是與牛直接接觸導致感染。目前由于集約化、規模化養殖的不斷提升及養殖技術、生物安全管理的不斷加強,牛群與豬群直接接觸的機會較少,BVDV病原的直接有效傳播基本被阻斷。但隨著CSF疫苗與牛源生物制品的廣泛應用,BVDV 間接感染豬群的事件時有報道[6]。利用本研究中建立的雙重RT-qPCR檢測方法對7個不同生產商購買的胎牛血清檢測出5個BVDV陽性血清,表明商品化牛血清中存在BVDV污染。商品化牛血清的品質與牛場生物安全及BVDV控制情況息息相關,目前生產廠家普遍采用輻射滅菌殺死病原微生物,雖然其不具有傳染性,但感染BVDV的牛血清用于種毒繁殖可能會中和CSFV導致豬瘟抗原效價偏低,且隨著細胞苗的大規模使用,有必要保證其生產過程及終產品的有效性和安全性,因此對CSFV和BVDV進行鑒別檢測有較大意義。

4 結 論

本研究構建了一種CSFV和BVDV雙重鑒別診斷RT-qPCR方法,可滿足生產實踐和臨床檢測的需要,為CSFV和BVDV的鑒別診斷提供了更加敏感的檢測方法,也為我國豬瘟的凈化提供了新的技術支撐。