基于GNS蛋白的牛流行熱病毒感染與免疫鑒別診斷ELISA方法的建立

何辰香,高閃電*,田占成,獨軍政,王錦明,關貴全,殷 宏,2*

(1.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 動物疫病防控全國重點實驗室,蘭州 730046;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心,揚州 225009)

牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)是彈狀病毒科、暫時熱病毒屬的代表性物種,可引起牛高熱、呼吸迫促、消化機能障。BEFV目前分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)的40多個國家,導致奶牛產奶產量嚴重減少、癱瘓或死亡,造成嚴重的經濟影響[1]。病毒RNA編碼10個基因,其中N、P、M、L和G基因編碼病毒結構蛋白,GNS、α1、α2、α3、β 和 γ編碼非結構蛋白[2-3]。G 蛋白是病毒保護性抗原,α1 可以結合 importin β1 和 importin 7 來調節(jié)核內運輸途徑,α3可與核內不均一性核糖核蛋白K互作引起細胞凋亡并促進BEFV復制,但其它非結構蛋白的功能尚未完全闡明[4-5]。

在血清學診斷方面,微量中和試驗以及基于G蛋白ELISA檢測可用于非疫苗免疫動物BEFV感染的診斷,但不能區(qū)分疫苗接種和自然感染動物[6-8]。作者前期全面篩選可用于疫苗免疫和自然感染甄別的病毒抗原,發(fā)現BEFV GNS蛋白N端截短體、GNS蛋白C端截短體、α2等蛋白可用于BEFV感染牛和免疫牛血清抗體甄別,且GNS蛋白N端截短體與GNS蛋白C端截短體均具有較好的反應原性[9]。在實際應用中,作者以蛋白復合物為檢測抗原以增加檢測準確度[10]。為了避免制備蛋白復合物的繁瑣流程,本研究利用大腸桿菌表達系統制備GNS全長蛋白,建立了一種與現有疫苗配套的鑒別診斷ELISA方法,為BEFV血清流行病學監(jiān)測和防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BEFV HN1/2012株 cDNA、pPROEXHTb原核表達載體、BEFV臨床血清樣本、陰性血清、標準陽性血清、標準陰性血清、感染血清,FMDV O型、A型標準免疫血清、Trans5α、Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞,均保存于中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所動物疫病防控全國重點實驗室。BEF滅活疫苗、BVD-IBR二聯滅活疫苗免疫牛血清,由寧夏農林科學院動物科學研究所王建東老師惠贈。

1.2 主要試劑

DNA聚合酶、即用型無縫克隆試劑盒、Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂以及化學發(fā)光試劑盒,為工生物工程(上海)股份有限公司產品。辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG購自Sigma公司。

1.3 原核表達載體構建

以HN1/2012株cDNA為模板,利用GNS(nt31-666)上游引物:5′-TTTCAGGGCGCCATGGGAT-CCGTATACTGTGTAAAAACCTC-3′、GNS(nt 673-1635)下游引物:5′-TCCATGGGATATCGGGGAT-CCTGATGATTCCTCATTCCAATA-3′PCR擴增并進行膠回收,之后利用快速克隆試劑盒與BamHⅠ、HindⅢ預先處理的pPROEXHTb載體進行重組,經轉化、菌落PCR篩選、測序驗證獲得重組表達載體pPRO-GNS。

1.4 重組蛋白His-GNS的表達純化及鑒定

將pPRO-GNS轉化Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞,在100 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng),在OD值達到0.6～0.8時加入IPTG(終濃度為1.0 mmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng),6 h后收集菌體進行SDS-PAGE確定目的蛋白His-GNS的表達。離心收集菌體重懸于10 mL PBS中,超聲波處理20 min (功率40 W,每破碎5 s后間隔2 s),然后10 000g4 ℃離心10 min,進行可溶性分析確定目的蛋白的可溶性。參照Ni-NTA瓊脂糖純化樹脂操作說明,對沉淀中的目的蛋白進行純化,利用透析液(10 mmol·L-1Tris, pH 8.0, 0.1% TritonX-100)透析過夜,保存?zhèn)溆谩７謩e利用1∶200倍稀釋的BEFV感染牛血清、BEF疫苗免疫牛血清為一抗,HRP標記兔抗牛IgG(1∶8 000)為二抗,進行Western blot鑒定。經一抗、二抗分別孵育1 h,用TBST洗膜3次,利用超敏化學發(fā)光底物室溫避光作用5 min并拍照保存。

1.5 間接ELISA方法的建立

1.5.1 抗原最佳包被濃度和血清稀釋度的確定 用碳酸鹽包被液將不同濃度的His-GNS蛋白(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg·mL-1)包被酶標板,4 ℃ 放置12 h;經5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h,依次加入1∶10或1∶20 稀釋的BEFV陽性血清和陰性血清、辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG(1∶4 000)、TMB底物、終止液,之后測定OD450 nm值。所用稀釋抗原、待檢血清以及辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG的體積為100 μL,在加入前均利用PBST洗滌酶標板3次。待檢血清和辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG的孵育時間均為30 min,TMB作用時間為10 min。最終根據陽性血清OD450 nm與陰性血清OD450 nm比值(P/N值)判定最佳反應條件。

1.5.2 辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG最佳稀釋倍數確定 按照上述最佳抗原包被濃度和血清稀釋度,利用1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀釋辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG,進行ELISA,根據最大P/N值確定辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG的最佳稀釋度。

1.5.3 臨界值確定 選取前期利用標準G蛋白抗體ELISA確定的28份陰性牛血清和32份自然感染BEFV的陽性牛血清進行檢測,利用公式S/P=(樣品OD450 nm-平均陰性對照OD450 nm)/(平均陽性對照OD450 nm-平均陰性對照OD450 nm)計算S/P值,應用MedCalc v20.0.10進行交互式點圖分析,確定cut-off值。

1.5.4 敏感性試驗 利用建立的間接ELISA,將陽性血清按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋,測定其OD450 nm,同時設定陰性對照,計算不同稀釋度血清的S/P值。

1.5.5 特異性試驗 利用建立的ELISA方法,分別對BVD-IBR雙價疫苗免疫牛血清、FMDV O型、A型、BEFV感染牛血清進行檢測,重復測定3次,確定方法的特異性。

1.5.6 重復性試驗 分別在同一批包被的酶標板進行5次檢測(批內)和5個不同批次制備的酶標板對6份待檢血清進行檢測,計算變異系數評價ELISA方法的批內、批間重復性。

1.6 臨床樣本檢測

利用建立的間接ELISA方法檢測來源于江蘇某奶牛場BEF滅活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛場BEF滅活疫苗免疫牛血清146份并統計檢測結果。

2 結 果

2.1 GNS表達載體的構建

以HN1/2012株cDNA為模板進行PCR擴增,獲得了1 605 bp的GNS目的基因片段(圖1A),與BamHⅠ、HindⅢ雙酶切處理的pPROEXHTb載體進行重組,菌落PCR鑒定結果表明10個克隆均為陽性(圖1B),測序表明重組質粒pPRO-GNS具有正確的讀碼框。

M1. DL5000 DNA相對分子質量標準;M2. DL2000 DNA相對分子質量標準;1. GNS擴增產物;2～11.菌落PCR 擴增產物M1. DL5000 DNA marker; M2. DL2000 DNA marker; 1.Amplification product of GNS; 2-11. PCR product of individual colony圖1 GNS擴增(A)及重組原核表達質粒鑒定(B)Fig.1 The amplification of GNS(A) and identification of recombinant prokaryotic expression plasmids(B)

2.2 重組蛋白的表達純化與Western blot鑒定

將重組質粒pPRO-GNS轉化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞,利用終濃度1.0 mmol·L-1的IPTG誘導,SDS-PAGE顯示目的蛋白相對分子質量約為73 ku,主要存在于超聲沉淀中,純化獲得較為單一的His-GNS重組蛋白(圖2)。Western blot結果顯示,重組蛋白His-GNS可與BEFV感染血清發(fā)生特異性反應(圖3A),而不與BEF疫苗免疫血清反應(圖3B)。

M. 蛋白相對分子質量標準;1. 未誘導pPRO-GNS重組菌;2～4. 4～6 h誘導的pPRO-GNS重組菌;5. 誘導pPRO-GNS重組菌裂解上清;6.誘導 pPRO-GNS重組菌裂解沉淀;7.純化的His-GNS蛋白M. Protein molecular weight marker; 1. Uninduced pPRO-GNS recombinant bacteria; 2-4. 4-6 h induced pPRO-GNS recombinant bacteria; 5. Supernatant fraction of induced pPRO-GNS recombinant bacteria; 6. Sediment fraction of induced pPRO-GNS recombinant bacteria; 7. Purified His-GNS protein圖2 His-GNS重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant His-GNS protein

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 抗原包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 方陣滴定結果表明,在His-GNS蛋白包被濃度為0.5 μg·mL-1,血清稀釋度為1∶20條件下,P/N值最大。因此,確定 0.5 μg·mL-1的抗原包被濃度和1∶20的血清稀釋度為最佳反應條件。

2.3.2 辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG最佳稀釋倍數確定 利用1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG酶標二抗進行檢測,結果在稀釋度為1∶4 000時,P/N值最大,因此確定辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG的最佳稀釋度為1∶4 000。

2.3.3 臨界值的確定 檢測背景清晰的28份陰性牛血清和32份陽性牛血清并根據OD450 nm值計算S/P值,結果表明,當敏感性為97%、特異性為100%時,其最優(yōu)cut-off值為0.206 9,因此確定ELISA的臨界值為S/P值0.206 9(圖4)。

圖4 臨界值判定Fig.4 Determination of cut-off value

2.3.4 敏感性試驗 利用建立的間接ELISA對陽性感染血清進行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍比稀釋測定,結果表明當血清稀釋度為1∶160時,仍判為陽性(S/P>0.206 9),表明建立的ELISA具有較好的敏感性。

2.3.5 特異性試驗 利用建立的ELISA方法,分別對BVD-IBR雙價疫苗免疫牛血清、FMDV O型、A型、BEFV感染血清進行檢測,結果顯示只有BEFV感染牛血清檢測結果為陽性,其余全為陰性(圖5),表明建立的ELISA方法具有較好的特異性。

圖5 特異性試驗結果Fig.5 Specific experimental results

2.3.6 重復性試驗 統計結果顯示,建立的ELISA批內變異系數為6.59%～9.90%,批間變異系數為4.83%～9.93%,均小于10%,表明所建立的間接ELISA方法具有較好的重復性。

2.4 臨床樣本檢測

利用建立的間接ELISA方法檢測來源于江蘇某奶牛場BEF滅活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛場BEF滅活疫苗免疫牛血清146份并統計檢測結果 (圖6),從江蘇奶牛場檢出3份陽性血清,陽性率為3.15%;從云南奶牛場檢出5份陽性血清,陽性率為3.42%。

圖6 臨床樣本檢測結果Fig.6 Test results of clinical samples

3 討 論

牛流行熱至今已有150余年的歷史,該病主要感染奶牛和黃牛,其特點是發(fā)病率高死亡率低,但近年來在我國河南省和臺灣省以及國外的土耳其等地均報道了該病在牛的較高病死率,引起較為廣泛關注[11-14]。利用滅活疫苗免疫是牛流行熱防控必不可少的重要措施,但現有抗體診斷方法無法區(qū)別牛自然感染BEFV或BEF疫苗免疫產生的抗體,因此感染與免疫鑒別診斷方法的建立成為牛流行熱防控中亟待解決的問題。

作者在前期證實GNS截短體的反應原性的基礎上,進一步表達純化獲得了GNS全長蛋白并建立了ELISA方法。作者發(fā)現GNS全長蛋白只與BEFV感染牛血清反應而不與疫苗免疫牛血清反應,表明滅活疫苗中不含GNS蛋白或含量很低不足以在免疫牛產生抗體,且本研究進一步證實GNS與牛常見病毒FMDV、BVDV、IBRV抗體均不存在交叉反應,特異性良好,是一種理想的鑒別診斷靶標。與作者前期基于GNS截短重組蛋白建立的ELISA方法[9]相比,本研究發(fā)現利用GNS全長重組蛋白建立ELISA,其抗原最佳包被濃度(0.5 μg·mL-1)和待檢血清濃度(1∶20)低于GNSaa 11-222截短重組蛋白包被濃度(1.0 μg·mL-1)和待檢血清濃度(1∶10),可能在于全長GNS重組蛋白較截短重組蛋白含有較多的抗原表位,更適用于抗體診斷試劑盒制備。通過陽性血清系列稀釋,血清稀釋度為1∶160仍可檢出,本研究建立的ELISA 與作者前期建立的基于G蛋白的ELISA方法具有類似的敏感性[15],且批內和批間CV均小于10%,表明該DIVA ELISA具有良好的敏感性和重復性。由于現有血清學診斷方法只能通過中和抗體判定牛的BEF疫苗接種史或自然感染史,但不能進行甄別。本研究在方法建立過程中,利用前期基于G蛋白抗體ELISA方法篩選的健康牛血清和BEFV自然感染牛血清進行標定,確保了檢測BEFV感染的準確率(結果“2.2.3”)。通過檢測源于江蘇某奶牛場BEF滅活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛場BEF滅活疫苗免疫牛血清146份,結果從江蘇和云南疫苗免疫群體檢出BEFV 感染率分別為3.15%和3.42%,與前期報道江蘇省免疫牛的BEF發(fā)病率一致[16],但略低于云南省部分地區(qū)未免疫牛的BEFV感染率(4.93%～21.69%)[17],進一步表明疫苗免疫在阻斷BEFV中起到至關重要的作用。

4 結 論

本研究利用原核表達系統成功表達純化BEFV GNS全長蛋白,從包涵體中純化復性獲得只與BEFV感染牛血清具有反應特異性的重組GNS蛋白,建立了BEFV感染與疫苗免疫鑒別診斷的間接ELISA方法,具有良好的敏感性、特異性和重復性,適用于BEFV自然感染和疫苗免疫牛的鑒別診斷,為我國牛流行熱診斷提供了新的技術儲備。