抗恩拉霉素多克隆抗體的制備

葉健強，康潤敏，余 華

（1.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066；2.四川省畜牧科學研究院，成都 610066；3.四川出入境檢驗檢疫局，成都 610041）

恩拉霉素（Enramycin，Er）又名恩霉素、安來霉素和持久霉素［1，2］，其主要成分是恩拉霉素A（C107H138N26O31C12R=CH3）和恩拉霉素B（C108H140N26O31C12R=C2H5OH），其結構式見圖1。該藥因具有很強的抗格蘭氏陽性菌的作用，用作飼料添加劑能促進畜禽生長和提高飼料效率，與其他抗生素亦無交叉耐藥，化學性能穩定，無致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，殘留極少，適口性好。中國于1988年農業部批準進口獸用恩拉霉素抗生素，但隨著國內外養殖量的日益增加，飼養者為了追求產量，往往超量應用獸藥、抗生素添加劑，造成動物性產品中有害化學殘留物質日趨嚴重，這不僅加大了動物產品威脅人類健康的風險，也直接重創了中國動物產品出口貿易。因此，進出口動物性食品中該藥物的殘留問題備受關注，這就使建立恩拉霉素殘留的快速測定方法并應用于畜禽產品的安全控制具有重要性和必要性。

圖1 恩拉霉素（含A 和B）結構式

酶免疫測（EIA）中酶聯免疫吸附測定法（ELISA）因較傳統的微生物檢測法、理化檢測法具有簡潔、快速、廉價、特異性強、靈敏度高等優點，已經被國內外廣泛應用于獸藥殘留的檢測中，但國內外鮮有有關恩拉霉素酶免疫檢測技術報道［3-6］，檢索到日本厚生省對畜、水產食品中有該項殘留的常規檢測技術報道［7］。為此，本試驗旨在制備一種特異性的恩拉霉素多克隆抗體，為間接競爭性ELISA 快速檢測恩拉霉素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試驗動物

1.1.1 試驗材料 恩拉霉素［純度≥98% ，由國家質檢總局科技計劃項目（2008IK013）課題組提純］。戊二醛（成都金山化學試劑公司）、1，4-二氧六環（成都科龍化工試劑廠）、Na2HPO4·2H2O（天津博迪化工公司）、乙二胺四乙酸二鈉（天津華興精細化工公司）、NaH2PO4和碳酸鈉（成都長聊化工試劑有限公司）、牛血清白蛋白（BSA，MW67000，上海博奧生物科技公司）、卵清蛋白（OVA，MW45000，上海基星生物科技公司）、弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FICA）（美國Sigma 公司）、透析袋（截留分子量14 000，美國Sigma公司），以上化學試劑均為分析純。

1.1.2 試劑的配制與用品準備 取0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液72.0 mL、0.2 mol/L 磷酸二氫鈉28.0 mL 于250 mL 三角瓶中，配成pH 7.2 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。用移液管吸取0.25 mL 戊二醛，將其配成100 mL 溶液，得0.25%的戊二醛溶液。

透析袋處理液，配制含碳酸鈉10 g/L 及乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）1 mol/L 的堿性EDTA 溶液；1%瓊脂糖配制，取15 g 瓊脂糖加100 mL pH 7.1 磷酸鹽緩沖液內，置水浴充分溶解，加入1 mL 1% 硫柳汞，待冷至45～50 ℃時，滴加到潔凈載玻片上，待凝固放入帶蓋的瓷盤中備用。用孔徑3.0 mm 打孔器在瓊脂載玻片上下平行打孔，孔距2.5 mm。

1.1.3 主要儀器 UV2501-PC 型紫外掃描儀（日本島津Shimadzu 公司）、酶標儀（Bio-Tek ELX800 型）、各種規格移液槍（Eppendorf）、BS100S 型分析天平（北京賽多利斯公司）、DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器公司）、高速冷凍離心機（HITACHI SCR20BC）、Freeze 6 型冷凍干燥機（Labconco 公司）、漩渦振蕩儀、恒溫水浴鍋、ULT1386-3-V38 型低溫冰箱（美國REVCO 公司）、DCD-172K 型常規冰箱（美國伊萊克斯公司）等。

1.1.4 試驗動物 健康雄性2 月齡試驗用清潔級新西蘭大白兔50 只，體重為2.0～2.5 kg/只，3 種偶聯率的人工抗原Er-BSA（7#、4#、6#），每種抗原分別采用3 種免疫程序進行免疫，將50 只試驗兔隨機分為9 組，每組5 只試驗兔，陰性對照5 只。飼養管理，所用兔子分籠飼養，自由飲食。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫抗原的制備 采用戊二醛法，將Er 與牛血清蛋白（BSA）偶聯為復合物，再加入弗氏完全佐劑制成抗原乳劑。分別稱取20 mg Er 盛于100 mL錐形瓶中和20 mg BSA 置于5 號試管中，并向試管中加入配好的PBS 溶液約3 mL，待BSA 完全溶解后轉移到有Er 的錐形瓶中，再用PBS 洗滌試管且將BSA完全移入錐形瓶。待Er 溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環10 mL，混勻。將磁力攪拌子放入反應器后把錐形瓶放在一個含少量水的大燒杯中，再將燒杯置于25 ℃水浴，開啟攪拌器，約5 min 后，保持攪拌狀態，向反應器內逐滴加0.25%戊二醛溶液5 mL，滴加完畢后仍保持攪拌狀態，反應4 h 以上；然后將反應液裝入透析袋中用堿性透析液（碳酸鈉10 g/L，EDTA 1 mol/L）透析72 h，每4 h 換液一次，透析后離心，上清液冷凍干燥，4 ℃保存。抗原和弗氏完全佐劑或不完全佐劑以1∶1 的比例乳化。

1.2.2 包被抗原的合成 反應過程同“1.2.1”方法，只需將BSA 換成OVA 即可。

1.2.3 免疫方案確定 本試驗設計了3 種免疫程序的試驗組進行免疫試驗，具體免疫技術方案如表1所示。

表1 試驗動物免疫技術方案

首先取1 mg/mL（以載體蛋白含量計算）人工抗原解凍，在無菌狀態下以適量生理鹽水稀釋后，滴加到等體積的佐劑（FCA 或FICA）中，混合乳化后成油包水（W/O）狀態用滅菌水使免疫的最終濃度為1 mg/mL，據表1 技術方案各組分別進行相關程序執行。免疫前和3 免疫后開始每次免疫后一周采耳緣靜脈血1 mL，4 ℃放置4 h 后3 000 r/min 離心10 min取血清，將血清與甘油（1∶1）等體積混和，保存于-20 ℃冰箱，用于試血。各組于尾免后7 d 采用心臟直接采血法采血，20～30 mL/只；按“1.2.1”方法分離血清，分裝和保存。

1.2.4 抗體效價的初步測定 血清效價的初步檢測采用瓊脂雙向免疫擴散法測定，具體設計方法為，上排孔加入抗原Er-BSA 或Er-OVA，下方孔依次是2、4、8、16、32 倍稀釋的抗Er-BSA 血清和陰性血清。判定標準，經37 ℃保溫24 h 后觀察抗體與抗原孔之間有無沉淀線產生，若有，則可判為陽性，同時借以判定是否有特異性的抗體產生以及抗血清的效價，當效價在1∶16 以上即可決定放血。

2 結果與分析

2.1 人工抗原的紫外光譜鑒定

采用UV2501-PC 型紫外掃描儀對Er、BSA、OVA 和2 種制備抗原進行紫外全波段掃描，波長范圍在200～400 nm［8-11］。結果表明，Er 標準品紫外最大吸收波長為279 nm，BSA 紫外最大吸收波長為278 nm。當Er 與BSA 偶聯形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波長偏移至Er 和BSA 特征峰之間，提示本次合成得到Er與BSA偶聯的免疫抗原Er-BSA（圖2）。而Er 和OVA 偶聯產物的紫外全波段掃描曲線比反應物OVA 峰形緩，278 nm 的最大吸收峰稍向左移，形狀更接近于Er，初步說明偶聯成功（圖3）。此外，此次所得Er-OVA 產物曲線比之前的Er-BSA 曲線稍有波動，可能與反應物純度有關。BSA 的純度達98%，而OVA 純度不到90%。其抗原偶聯比、免疫抗原Er-BSA 和包被抗原的偶聯比均為26∶1。

圖2 免疫抗原與BSA、Er 紫外全掃描

圖3 包被抗原與OVA、Er 紫外全掃描

2.2 瓊脂雙向免疫擴散法測定抗血清效價

用瓊脂雙向免疫擴散法測定抗血清效價，上排孔為Er-BSA 免疫抗原時，其測定結果見表2。由表2 可知，4 免后B 組（加強免疫組）兔抗血清的效價最高，其中B 組7#抗原免疫家兔后獲得的兔抗血清最高效價達16；A 組（常規組）效價中等，最高可達8；C 組抗血清效價最低，為2，應予以淘汰。

表2 瓊脂雙向免疫擴散法測定抗血清效價結果

4 免后，上排孔為Er-OVA 和Er-BSA 兩種抗原時，兔抗血清沉淀線都可見，如圖4 所示，由此說明，本試驗中，加強組免疫程序的免疫效果較好，且能產生較高效價特異性強的抗體。

圖4 瓊擴法測定抗血清效價情況

3 討論

Er 是一種僅具反應原性而不具免疫原性（抗原刺激機體發生特異性免疫反應，從而產生抗體的性質）的小分子半抗原，其結構中氨基和酚基均可作為偶聯基團，但酚基偶聯的效果不佳，故選用氨基為偶聯基團，而將其與載體蛋白相連接的方法主要是重氮化法和戊二醛法。但用重氮化法合成全抗原，一般通過紫外掃描顯示偶聯物與載體蛋白的吸收峰完全重疊，故放棄此法［12-14］。戊二醛是常用的帶有2個活性基團的雙功能連接劑，借助其兩端的醛基將載體和半抗原的氨基通過共價鍵連接在一起。本試驗以戊二醛為偶聯劑，將載體蛋白氨基與半抗原Er分子中D-Orn4 和Cit-9 上的氨基偶聯，整個偶聯反應在PBS 和二氧六環反應條件下進行，其中PBS 可穩定反應的pH，并為反應提供水溶液環境，二氧六環既可調整反應環境的極性條件，又能促進醛基的反應，最終獲得全抗原Er-BSA 和Er-OVA，且通過紫外光掃描表明偶聯成功［15，16］。

本試驗中采用2 月齡2.0～2.5 kg 大白兔為免疫對象，主要是適宜的年齡和體重可減少免疫耐受率，同時增強免疫應答效果，以保證產生合格抗體。此外，免疫時采用皮內免疫方式，不僅能減少免疫劑量，而且更適合于如Er 類人工合成成本高、量少等微量抗原的使用；同時，該方式可替代靜脈加強法，不僅減少工作量、降低成本，而且可減少過敏反應的致死率。

在測定抗血清效價時，A 組和C 組分別在4 免和5 免后，經檢測其抗血清的效價較低，而B 組4 免后獲得的抗血清已經符合試驗要求，由于本試驗合成的抗原數量有限、成本過高等局限，因此僅選擇B 組而放棄其他免疫程序的試驗組，進而沒有進一步免疫其他試驗組的試驗動物。在抗血清特異性方面，因為用Er-BSA 免疫動物產生的抗體有抗Er 和抗BSA 抗體，結果顯示，當Er-BSA 為上排孔抗原時出現陽性，但這并不能證明抗Er 抗體的產生，因此用Er-OVA 抗原進行驗證，仍可見有明顯沉淀線，表明BSA與Er-BSA、Er-OVA 及OVA均不發生交叉反應。