當歸多糖改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的體內外觀察及其機制探討

葉建華，沈盛暉，張田杰，馮頻頻

1 浙江省立同德醫院心血管科，杭州 310012；2 浙江省立同德醫院藥劑科

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是指心肌在缺血情況下受到損傷，再灌注后心肌細胞的超微結構和電生理特征被破壞，導致組織損傷加重。MIRI 能夠降低細胞活力，造成不可逆損傷［1］，表現為肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）升高，血壓突然下降，缺血再灌注心律失常等［2］。MIRI 的發病機制主要包括內皮細胞炎癥反應、細胞凋亡、線粒體損傷、氧化應激等，并且各種機制的信號通路可能存在相互作用［3］，其中炎癥反應是MIRI 的主要病因［4］。toll 樣受體4（TLR4）能夠通過調節核因子κB（NFκB）信號通路激活機體炎癥和免疫系統［5］，當機體受到各種生理或病理刺激時，活化的TLR4 通過細胞內轉導啟動下游信號級聯，激活NF-κB 進入與靶序列結合的細胞核，促進炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、IL-1β 的表達，加重心肌組織損傷［6］。細胞凋亡是MIRI 另一重要病因，缺血時抗凋亡基因B 淋巴細泡瘤2（Bcl-2）和促凋亡基因Bcl-2 關聯X 蛋白（Bax）的平衡穩態被破壞，共同參與凋亡基因表達及細胞凋亡蛋白酶信號轉導，進而調控細胞凋亡［7-8］。當歸多糖（ASP）是當歸的水溶性活性物質，具有廣泛的藥理作用，被發現能夠減輕大腦缺血再灌注損傷［9］。然而，ASP 在MIRI 中的作用仍不確定。2022 年10 月—2023 年2 月，本研究觀察了ASP 對MIRI 大鼠及體外心肌細胞缺氧復氧（H/R）模型的影響，并探討ASP 對免疫炎癥及細胞凋亡的重要信號通路TLR4/NF-κB 的調控作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級SD大鼠，體質量250～280 g，購自浙江省實驗動物中心，研究方案經浙江省實驗動物中心機構動物照顧與使用委員會批準（ZJCLAIACUC-20030043），所有程序均遵循國際指南2.0［10］。ASP 購自浙江省立同德醫院，CK-MB、LDH、IL-1β、IL-6、TNF-αELISA 試劑盒購自中國Boster，miRNA 熒光定量PCR 試劑盒及miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒均購自上海生工，TLR4/NF-κB 信號通路關鍵蛋白TLR4、磷酸化核蛋白（p-p65）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白α（p-IκBα）抗體均購自美國Abcam 公司，細胞凋亡相關因子Bcl-2、Bax、裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）抗體均購自美國Cell Signaling公司。

1.2 ASP改善大鼠MIRI的體內觀察

1.2.1 大鼠MIRI 模型建立及分組處理 將成年SD大鼠隨機分為假手術組、MIRI組、ASP低劑量組、ASP 高劑量組，每組15 只。除假手術組外，均采用冠狀動脈左前降支結扎30 min，再灌注120 min的方法建立MIRI 模型。ASP 低、高劑量組在建模后分別給予50、100 mg/kg的ASP 灌胃，每天1次，假手術組及MIRI組給予等量生理鹽水灌胃，持續4周。

1.2.2 大鼠血清心肌損傷標志物及炎癥因子檢測 采用ELISA 法。取建模4 周后各組大鼠，腹主動脈插管后取血離心得到血清，采用ELISA 試劑盒檢測大鼠血清心肌損傷標志物CK-MB、LDH 及血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 大鼠心肌組織凋亡及TLR4/NF-κB 通路相關蛋白檢測 采用Western blotting 法。提取各組大鼠心肌組織，用BCA 法進行蛋白定量，用10% SDSPAGE 凝膠分離蛋白，將蛋白轉至膜上。用5%牛血清白蛋白封閉1 h，分別加入Bax、Bcl-2、TLR4、p-p65、cleaved Caspase-3、p-IκBα、β-actin 一抗，置于4 ℃冰箱中封閉過夜。次日，用PBST 溶液洗膜，而后加入相應二抗，室溫避光條件下孵育35 min。以PBST洗膜后，將NC膜放入掃膜儀中獲取圖像，計算目的蛋白相對表達量。

1.3 ASP改善大鼠MIRI的體外觀察

1.3.1 大鼠心肌細胞分組與H/R模型建立 SD大鼠稱重，腹腔注射肝素（5 U/g），20 min 后腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉進行麻醉。迅速開胸取出心臟，將主動脈根部懸掛于Langendorff 裝置，調節灌流液流速至3 mL/min，用臺式液灌流3 min，換酶液灌流消化25 min。待心臟軟化后，剪下心臟部分，于酶液中剪碎，鈍口玻璃吸管輕輕吹打，經細胞濾網過濾，除去較大的組織塊，離心棄上清。將細胞梯度復鈣，細胞預貼壁1 h 后，更換培養基于敷箱中培養，24 h 后更換新的培養基。將大鼠心肌細胞分為對照組、H/R 組、H/R+ASP 低劑量組、H/R+ASP 高劑量組，對照組正常培養不做處理，其他3 組均建立H/R 模型。建模方法：將心肌細胞置換到細胞培養基中，隨后置入5% CO2，95%氮氣培養箱中培養5 h 造成心肌細胞缺氧。用含有20%胎牛血清的DMEM 培養基置換原細胞培養液，37 ℃ 5% CO2培養箱中培養12 h造成心肌細胞復氧。

1.3.2 大鼠心肌細胞活性檢測 采用MTT 比色法。在96 孔培養板中每孔加入100 μL細胞懸液，放入培養箱中培養，至細胞單層鋪滿孔底，H/R+ASP低劑量組加入濃度為5 μg/mL 的ASP，H/R+ASP 高劑量組加入濃度為10 μg/mL 的ASP，H/R 組不做處理正常培養，繼續5% CO2、37 ℃孵育24 h，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，繼續培養4 h后結晶充分形成后去掉上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用分光光度法在570 nm處測定吸光度（A）值，以此代表細胞活性。

1.3.3 大鼠心肌細胞炎癥因子檢測 采用ELISA試劑盒檢測培養上清液中心肌細胞IL-1β、IL-6、TNF-α，方法同“1.2.2”。

1.3.4 大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白及TLR4/NFκB 通路相關蛋白檢測 采用Western blotting 法。取各組培養上清液，Western blotting 法檢測心肌細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 及TLR4/NF-κB 通路相關蛋白TLR4、p-p65、p-IκBα，方法同“1.2.3”。

1.4 統計學方法 采用SPSS10.0 統計軟件。計量資料正態性分析采用Kolmogorov-Smirnov檢驗，符合正態分布的資料以-x±s表示，組間比較行t檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ASP改善大鼠MIRI的體內觀察結果

2.1.1 各組血清心肌損傷標志物水平比較 血清心肌損傷標志物LDH、CK-MB水平MIRI組＞ASP低劑量組＞ASP高劑量組＞假手術組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組血清LDH、CK-MB水平比較（U/L，-x ± s）

2.1.2 各組血清炎癥因子水平比較 血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平MIRI 組＞ASP 低劑量組＞ASP高劑量組＞假手術組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，-x ± s）

2.1.3 各組心肌組織凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 表達比較 心肌組織Bax、cleaved Caspase-3 蛋白表達MIRI 組＞ASP 低劑量組＞ASP 高劑量組＞假手術組，心肌組織Bcl-2 蛋白表達假手術組＞ASP 高劑量組＞ASP 低劑量組＞MIRI 組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組心肌組織Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 蛋白表達比較（-x ± s）

2.1.4 各組心肌組織TLR4/NF-κB 通路相關蛋白表達比較 心肌組織TLR4/NF-κB 通路相關蛋白TLR4、p-p65、p-IκBα 表達MIRI 組＞ASP 低劑量組＞ASP高劑量組＞假手術組（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組心肌組織TLR4、p-IκBα、p-p65蛋白表達比較（-x ± s）

2.2 ASP改善大鼠MIRI的體外觀察結果

2.2.1 各組心肌細胞活性比較 對照組、H/R 組、H/R+ASP 低劑量組、H/R+ASP 高劑量組心肌細胞活性分別為99.87% ± 1.80%、61.45% ± 1.34%、71.33% ± 1.92%、82.96% ± 2.57%，心肌細胞活性對照組＞H/R+ASP 高劑量組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R組（P均＜0.05）。

2.2.2 各組心肌細胞炎癥因子水平比較 心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平H/R組＞H/R+ASP低劑量組＞H/R+ASP高劑量組＞對照組（P均＜0.05）。見表5。

表5 各組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，-x ± s）

2.2.3 各組心肌細胞凋亡相關Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 蛋白表達比較 心肌細胞Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達H/R 組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R+ASP 高劑量組＞對照組，心肌細胞Bcl-2 蛋白表達對照組＞H/R+ASP 高劑量組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R組（P均＜0.05）。見表6。

表6 各組心肌細胞Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達比較（-x ± s）

2.2.4 各組心肌細胞TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達比較 心肌細胞TLR4/NF-κB通路相關蛋白TLR4、p-p65、p-IκBα 表達H/R 組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R+ASP高劑量組＞對照組（P均＜0.05）。見表7。

表7 各組心肌細胞TLR4、p-IκBα、p-p65蛋白表達比較（-x ± s）

3 討論

MIRI 是一種心肌組織缺血缺氧后恢復供氧供血導致心肌組織呈進行性加重的病理進程，其發生與氧化應激反應、鈣離子超載、炎癥反應、線粒體形態功能障礙等有關，但是其具體機制尚不明了。中醫藥在治療MIRI方面具有藥理作用廣，毒性低等獨特優勢。多糖尤其是中藥多糖具有增強機體免疫功能及抗腫瘤等藥理作用，而且幾乎沒有毒性，因此近年來在MIRI 相關研究中備受關注。當歸是一種重要的中藥材，其主要功能為補血和血、調經止痛；兼有滋補強壯、扶正固本及活血化瘀之功效，為中醫內、外、婦、兒各科常用的主藥。對當歸多糖的生物活性研究表明，當歸多糖具有抗補體、增強造血功能、免疫調節、抑制肝損傷及促進潰瘍愈合的作用?；诖?，本研究使用傳統中藥當歸中提取的水溶性多糖ASP 干預MIRI 模型大鼠及體外心肌細胞缺氧復氧（H/R）模型，觀察其對體內外模型的影響并探討ASP 對免疫炎癥、細胞凋亡及TLR4/NF-κB 信號通路的干預作用，以期為MIRI 的防治提供新的方向。

心肌細胞受損后再灌注時，處于缺氧復氧狀態，線粒體、細胞膜遭到損傷，細胞膜通透性異常增加，引起細胞膜破壞以及心肌標志物外漏［11］。CK-MB為心肌壞死的重要標志物，當心肌細胞受到損傷時，血清CK-MB水平升高，CK-MB水平可作為診斷心肌壞死的金標準［12］。LDH 廣泛存在于心肌組織中，是評價心肌疾病發生發展的常用指標。本研究的體內觀察結果顯示，與假手術組比較，MIRI 組CK-MB、LDH水平升高，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β亦升高，提示MIRI 引起嚴重心肌損害并伴有大量炎癥因子產生。而經ASP 處理后MIRI 大鼠CK-MB、LDH 降低，同時炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 下降，且高劑量ASP 組下降更明顯，提示ASP 能夠通過減輕炎癥反應并改善心肌缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴性。

NF-κB 通路是調節MIRI 炎癥介質轉錄和生物合成的重要信號通路，在MIRI的發展中發揮了關鍵作用，可介導細胞凋亡、炎癥反應等多種生理過程［13］。TLR4 是toll 樣受體家族的一員，可觸發NF-κB 的活性，從而啟動炎癥因子的合成。作為NF-κB 不可缺少的上游調控分子，IκB 與NF-κB p65結合，使該通路失活。IκB 激酶復合物激活IκB，誘導p65 中IκB 的降解和解離；而IκBα 是IκB 的關鍵調控分子［14］。有研究顯示，NF-κB作為下游轉錄因子可在脂多糖刺激下被激活，誘導促炎細胞因子產生［15］。韓運祺等［16］研究發現，治療MIRI的核心靶點主要通過TLR、AGE-RAGE、MAPK 等相關通路發揮作用。劉啟祥等［17］研究表明，丁香酚可通過抑制NF-κB信號通路來減輕大鼠腎缺血再灌注損傷。本研究通過體外大鼠心肌細胞H/R模型亦發現，ASP處理后的大鼠心肌細胞活性增加，炎癥因子分泌減少，且TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達降低，細胞凋亡相關蛋白表達下調，提示ASP 可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減少細胞炎癥因子分泌來發揮對心肌細胞的保護作用。

TLR4 可在體內信號轉導過程中通過多種信號途徑與配體結合激活NF-κB，從而增加心肌細胞凋亡。心肌缺血時，大量受損心肌細胞逐漸出現凋亡。Caspase-3 作為核心執行蛋白參與線粒體途徑介導的凋亡過程，而cleaved Caspase-3 可反映其活性。凋亡執行蛋白中，Bax 有明確的促凋亡作用，而Bcl-2有明確的抑制凋亡作用［18］，兩者比值可有效反映細胞凋亡的程度。唐詠文等［19］研究觀察到SD 大鼠心肌缺血再灌注時有大量的心肌細胞凋亡，伴有凋亡蛋白表達異常。KHAZAEI 等［20］使用丹參多酚處理MIRI模型大鼠，發現丹參多酚可減少大鼠心肌梗死面積和心肌細胞凋亡，上調凋亡相關蛋白Bcl-2的表達，抑制Bax 和活化的Caspase-3。本研究結果顯示，在ASP處理后抑制細胞凋亡因子Bcl-2表達升高，促進細胞凋亡因子Bax 表達下降，提示ASP 可通過抑制心肌細胞凋亡途徑發揮對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，ASP在體內、體外缺血再灌注模型中均可改善大鼠MIRI，其機制可能與抑制TLR4/NFκB 通路激活、減輕炎癥反應、減少細胞凋亡有關。本研究旨在為目前關于MIRI 的藥理學預防和ASP在心肌損傷中的治療潛力提供新的方向，而ASP 在MIRI 中的特異性作用靶點尚不明確，有待進一步研究。