胃癌患者癌組織和血清外泌體中LncRNA CCAT1、miR-140-3p表達(dá)及其臨床意義

王琦，曹嘉誠，張宇，蔣志陽，陶國青

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院胃腸外科，江蘇無錫 214023

胃癌是發(fā)生于胃部組織的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，早期無特異性癥狀，患者通常以惡心、嘔吐等消化不良癥狀就診，至晚期時預(yù)后較差［1-2］。目前臨床上廣泛使用的腫瘤標(biāo)志物有血清癌胚抗原、糖類抗原199等，但這些指標(biāo)對胃癌的診斷仍有較大局限性［3］。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一種長度超過200 nt 的非編碼RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及表觀遺傳調(diào)控等過程，多種LncRNA 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程［4］。研究顯示，LncRNA 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（CCAT1）在多種腫瘤中表達(dá)異常增高，且與腫瘤分期及患者預(yù)后具有相關(guān)性［5-6］。微小核糖核酸（miRNA）是一種16～25堿基長度的單鏈小分子RNA，miR-140-3p是miR-140的一種存在形式，屬于miRNA 家族成員，被發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、乳腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)［7-8］。目前，關(guān)于LncRNA CCAT1、miR-140-3p 與胃癌的關(guān)系報道較少。2017 年1 月—2018 年1 月，本研究通過觀察胃癌患者癌組織和血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表達(dá)情況，分析兩者的相關(guān)性，探討其與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系及對胃癌的診斷價值，以期為胃癌的診治提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（KY2016395），選取2017 年1 月—2018 年1 月于我院行胃癌根治術(shù)的胃癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胃癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］且經(jīng)術(shù)后病理組織檢查確診；②初診且未接受任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②合并嚴(yán)重感染、免疫系統(tǒng)疾病；③心肝腎功能嚴(yán)重不全；④有精神性疾病或存在溝通障礙；⑤合并消化系統(tǒng)疾病。共選擇符合上述標(biāo)準(zhǔn)的胃癌患者93 例為胃癌組，另選擇我院同期就診的胃部良性病變且排除惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及心肝腎功能不全患者47例為良性病變組，同期在我院體檢的健康對象47例為健康對照組。胃癌組男62例、女31例，年齡（59.64 ±9.76）歲；良性病變組男27例、女20例，年齡（57.43 ±10.38）歲，慢性胃炎25例、胃潰瘍22例；健康對照組男29例、女18例。三組性別、年齡具有可比性。

1.2 胃癌及癌旁組織LncRNA CCAT1、miR-140-3p檢測 采用RT-qPCR 法。于胃癌根治術(shù)過程中留取患者腫瘤組織樣本和癌旁組織樣本，癌旁組織樣本采集區(qū)域需距腫瘤組織邊緣≥5 cm，將采集的樣本立刻放于液氮中快速冷凍，保存在-80 ℃低溫冰箱中。采用TRIzol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）從胃癌組織和癌旁組織中提取總RNA，NanoDrop2000 光度計測定RNA 濃度和純度。采用Takara Prime-Script 試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），采用2720 型熱循環(huán)PCR 系統(tǒng)（美國ABI 公司）及SYBR Green Mix 試劑盒（西安齊岳生物科技有限公司）對cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR Green qPCR Mix 10 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL，共20 μL。引物序列：LncRNA CCAT1 上游引物5'-TGCTCACCTTACTGCCTGAGC-3'，下游引物5'-GGAGCGCACAACCTAGATCC-3'；miR-140-3p 上游引物5'-CGAGAGTGAGATGCACTG-3'，下游引物5'-ATCCAGTGCAGGCGAGG-3'；GAPDH 上游引物5'-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3'，下游引物 5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'；U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 擴(kuò)增步驟：預(yù)變性95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；變性95 ℃ 10 s，40 個循環(huán)；退火55 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；延展72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH 為LncRNA CCAT1 的內(nèi)參，以U6 為miR-140-3p 的內(nèi)參，以2-ΔΔCt計算LncRNA CCAT1 及miR-140-3p 相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3 血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 檢測 采用RT-qPCR 法。采集所有研究對象靜脈血5 mL，胃癌組、良性病變組在未接受治療前采集，健康對照組于體檢當(dāng)日采集。血標(biāo)本在3 000 r/min下離心10 min，有效離心半徑10 cm，收集血清裝于含無核糖核酸酶的試管，保存于-80 ℃低溫冰箱中。取血清樣本25 ℃復(fù)融，4 ℃離心30 min，舍棄細(xì)胞碎片后再用注射過濾器過濾以盡可能去除細(xì)胞碎片，采用HiPure Exosome RNA Kit 外泌體提取試劑盒（美國Invitrogen 公司）提取血清外泌體沉淀，用PBS緩沖液重懸外泌體顆粒，取10 μL 懸液在銅網(wǎng)上吸附10 min，轉(zhuǎn)移至3%的戊二醛溶液中懸浮5 min，沖洗2 min 后用乙酸雙氧鈾染色1 min，自然干燥后使用Talos F200i透射電子顯微鏡［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］觀察外泌體的形態(tài)特征，另取10 μL懸液采用納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)（購自美國PSS 公司）檢測外泌體粒徑，使用Western blotting 法檢測外泌體表面標(biāo)記蛋白TSG101（TSG101 抗體購于賽默飛世爾科技公司）及CD54（CD54抗體購于賽默飛世爾科技公司）陽性表達(dá)情況。采用HiPure 外泌體RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司）從血清樣本中提取外泌體總RNA，RT-qPCR 法檢測血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 相對表達(dá)量，方法同“1.2”。

1.4 預(yù)后隨訪方法 胃癌患者出院以電話或門診復(fù)查隨訪5 年，隨訪頻率為前2 年每3 個月1 次，后3年每6 個月1 次，隨訪截止日期為2023 年1 月，隨訪終止事件為患者死亡或截止隨訪到期，記錄患者生存時間并計算5年生存率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。計量資料Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以-x±s表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析（F檢驗(yàn)）；計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)分析法分析患者癌組織及血清外泌體中LncRNA CCAT1 與miR-140-3p 的相關(guān)性；以胃癌患者癌組織LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表達(dá)的平均值為界限，將患者分為高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p 者，采用K-M 生存曲線比較高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p 患者5 年總生存率；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 對胃癌的診斷價值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌與癌旁組織LncRNA CCAT1、miR-140-3p表達(dá)比較 胃癌、癌旁組織LncRNA CCAT1 相對表達(dá)量分別為2.67 ± 1.15、1.32 ± 0.61，miR-140-3p相對表達(dá)量分別為1.72 ± 0.83、3.83 ± 1.46；胃癌組織LncRNA CCAT1 表達(dá)高于癌旁組織，miR-140-3p表達(dá)低于癌旁組織（P均＜0.05）。

2.2 各組血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p表達(dá)比較 健康對照組、良性病變組及胃癌組血清外泌體LncRNA CCAT1 相對表達(dá)量分別為0.72 ±0.24、1.71 ± 0.43、2.25 ± 0.89，miR-140-3p 相對表達(dá)量分別為3.79 ± 1.07、2.65 ± 0.87、1.58 ± 0.77；血清外泌體LncRNA CCAT1 表達(dá)健康對照組＜良性病變組＜胃癌組，miR-140-3p 表達(dá)健康對照組＞良性病變組＞胃癌組（P均＜0.05）。

2.3 胃癌患者癌組織及血清外泌體LncRNA CCAT1 與miR-140-3p 表達(dá)的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)分析顯示，胃癌患者癌組織及血清外泌體中LncRNA CCAT1表達(dá)與miR-140-3p表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.726、-0.639，P均＜0.05）。

2.4 不同病理特征胃癌患者癌組織及血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表達(dá)比較 不同腫瘤分化程度、浸潤深度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者癌組織及血清外泌體中LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位胃癌患者癌組織及血清外泌體中LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、2。

表1 不同臨床病理特征胃癌患者癌組織LncRNA CCAT1、miR-140-3p表達(dá)比較（-x ± s）

2.5 癌組織及血清外泌體不同LncRNA CCAT1、miR-140-3p 表達(dá)水平胃癌患者預(yù)后比較 93 例胃癌患者在隨訪過程中失訪2 例，91 例完成隨訪的患者中共生存48例，患者5年總生存率為52.75%。91例胃癌患者中癌組織、血清外泌體LncRNA CCAT1高表達(dá)者分別為45 例、48 例，患者5 年總生存率分別為35.56%（16/45）、37.5%（18/48）；LncRNA CCAT1 低表達(dá)者分別為46 例、43 例，患者5 年總生存率分別為69.57%（32/46）、69.77%（30/43）；miR-140-3p 高表達(dá)者分別為39 例、40 例，患者5 年總生存率分別為76.92%（30/39）、67.5%（27/40）；miR-140-3p 低表達(dá)者分別為52 例、51 例，患者5 年總生存率分別為34.62%（18/52）、41.18%（21/51）。癌組織及血清外泌體LncRNA CCAT1高表達(dá)的胃癌患者5 年總生存率低于LncRNA CCAT1 低表達(dá)患者，miR-140-3p 高表達(dá)的胃癌患者5 年總生存率高于miR-140-3p低表達(dá)患者（P均＜0.01）。

2.6 血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 對胃癌的診斷價值 以胃癌組為陽性樣本、良性病變組為陰性樣本行ROC 分析，結(jié)果顯示，血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 預(yù)測胃癌的曲線下面積分別為0.712、0.766，兩者聯(lián)合診斷胃癌的AUC 為0.845。見表3。

表3 血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p對胃癌的診斷價值

3 討論

胃癌是一種發(fā)病率及病死率均較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程［10-11］。研究顯示，不同臨床分期的胃癌患者預(yù)后差異較大，總體而言，早期胃癌臨床治療效果好，而中晚期胃癌臨床治療效果較差［12］。多數(shù)胃癌患者早期多為無癥狀或僅表現(xiàn)為反酸、噯氣、上腹不適等非特異性癥狀，容易被忽視，確診時多數(shù)患者已經(jīng)進(jìn)展為中晚期［13］。因此，及時診斷治療對提高胃癌患者的臨床療效、改善預(yù)后具有重要意義。

LncRNA 是一種具有高度組織特異性的非編碼RNA，參與乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。LncRNA CCAT1是位于染色體8q24.21 上的一種LncRNA，在多種腫瘤中表達(dá)異常增高。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織LncRNA CCAT1 表達(dá)高于癌旁組織，血清外泌體中LncRNA CCAT1 表達(dá)胃癌組高于良性病變組，良性病變組高于健康對照組，且腫瘤分化程度低、浸潤深度深、臨床分期高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織、血清外泌體中LncRNA CCAT1 表達(dá)較高。這提示LncRNA CCAT1可能參與了胃癌的發(fā)生與病理進(jìn)展過程，其機(jī)制可能為LncRNA CCAT1 表達(dá)上調(diào)通過調(diào)控癌基因蛋白激活了MAPK 信號通路，進(jìn)而增強(qiáng)了胃腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移［14］。

miRNA 是廣泛存在于真核生物的小分子非編碼RNA，通過作用于靶信使RNA 參與細(xì)胞增殖、分化過程。miR-140 基因位于外顯子16 和17 之間的E3泛素蛋白連接酶2基因上，miR-140-3p由miR-140前體轉(zhuǎn)錄而來，已被發(fā)現(xiàn)與多發(fā)性骨髓瘤、卵巢腫瘤、乳腺腫瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織miR-140-3p 表達(dá)低于癌旁組織，血清外泌體miR-140-3p 表達(dá)胃癌組低于良性病變組，良性病變組低于健康對照組，腫瘤分化程度低、浸潤深度深、臨床分期高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織和血清外泌體中miR-140-3p 表達(dá)較低。這提示miR-140-3p 可能作為抑癌基因參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，其機(jī)制可能為miR-140-3p一方面能夠直接靶向抑制抗凋亡基因AKT2 的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移；另一方面，miR-140-3p 能夠通過靶向環(huán)氧合酶2 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其表達(dá)降低導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡減少，更有利于腫瘤細(xì)胞的增殖［16］。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織、血清外泌體LncRNA CCAT1 與miR-140-3p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示LncRNA CCAT1可通過負(fù)向調(diào)控miR-140-3p參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，其機(jī)制可能為LncRNA CCAT1抑制miR-140-3p 表達(dá)激活自噬相關(guān)基因5，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲［17］。胃癌患者癌組織及血清外泌體中LncRNA CCAT1 高表達(dá)者5 年總生存率低于LncRNA CCAT1 低表達(dá)患者，miR-140-3p 高表達(dá)者5 年總生存率高于miR-140-3p 低表達(dá)者，提示癌組織及血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p表達(dá)與胃癌患者預(yù)后有關(guān)。其原因可能為LncRNA CCAT1 表達(dá)越高、miR-140-3p 表達(dá)越低，腫瘤分化程度越低，腫瘤浸潤深度越深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越嚴(yán)重，臨床分期越高，導(dǎo)致患者預(yù)后越差。本研究進(jìn)一步采用ROC 曲線分析血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p對胃癌的診斷價值，結(jié)果顯示，血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 及兩項聯(lián)合診斷胃癌的AUC 分別為0.712、0.766、0.845，提示兩項聯(lián)合診斷胃癌的效能較高。

綜上所述，胃癌患者癌組織及血清外泌體中LncRNA CCAT1 表達(dá)上調(diào)，miR-140-3p 表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與患者腫瘤分化程度、浸潤深度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及預(yù)后有關(guān)，血清外泌體LncRNA CCAT1、miR-140-3p 聯(lián)合對胃癌具有較高的診斷價值。由于本研究為單中心研究且樣本量相對較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定的偏倚，因此仍有待進(jìn)一步多中心、大樣本研究加以證實(shí)完善。