子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA OGFRP1、TDRG1表達(dá)變化及其與PI3K/AKT信號通路和預(yù)后的關(guān)系

邢堃，宋丹，康程

1 北京航天總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100076；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科

子宮內(nèi)膜癌（EC）是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，早期EC預(yù)后較好，但中晚期EC因缺乏有效治療方式預(yù)后較差［1］。因此，尋找相關(guān)分子標(biāo)志物有利于指導(dǎo)EC 的臨床治療。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類真核生物中長度大于200 nt的非編碼RNA 分子，能夠通過調(diào)控多種靶基因和信號通路參與EC的發(fā)生發(fā)展［2］。阿片類生長因子受體假基因1（OGFRP1）是新近發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，可用于預(yù)測結(jié)直腸癌患者的預(yù)后［3］，近期研究發(fā)現(xiàn)其在EC 中異常表達(dá)［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA TDRG1 對宮頸癌預(yù)后有一定的預(yù)測作用［5］，且其異常表達(dá)參與了EC 的發(fā)生發(fā)展［6］。既往研究顯示，磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路參與EC 的發(fā)生發(fā)展［7］。但是，LncRNA OGFRP1、TDRG1 在EC 中是否與PI3K/AKT 存在調(diào)控關(guān)系及其與預(yù)后的關(guān)系尚不明確。2016 年1 月—2019 年12 月，本研究觀察了EC 組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達(dá)變化并分析其與PI3K/AKT 信號通路和預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床防治EC提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)北京航天總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)［（2015）臨床（139）］，選取2016年1月—2019年12 月我院及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院收治的EC患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)實驗室檢查、病理檢查確診為EC；②心肝腎等臟器功能正常；③臨床資料完整；④受試者及家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期為Ⅳ期；②伴有急慢性感染、免疫系統(tǒng)疾病；③合并其他部位惡性腫瘤；④無法配合檢查及隨訪。共收集符合標(biāo)準(zhǔn)的EC 患者90 例，患者年齡（50.17 ± 5.82）歲，分化程度低分化39例、中高分化51例，組織學(xué)分型Ⅰ型75 例、Ⅱ型15 例，F(xiàn)IGO 分期Ⅰ～Ⅱ期55 例、Ⅲ期35例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例、未轉(zhuǎn)移72例。

1.2 EC 和癌旁組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 檢測方法 采用RT-qPCR 法。取EC患者病理活檢時腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織（距腫瘤組織≥5 cm 且經(jīng)病理證實為正常組織），使用TRIzol 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）提取EC患者癌組織和癌旁組織的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）合成cDNA，使用實時熒光定量試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。引物序列：LncRNA OGFRP1上游引物5'-TGGCTGCCCACAAGATAATG-3'，下游引物5'-GCCTCCCATCAAAAGCTCCT-3'；LncRNA TDRG1上游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，下游引物5'-TGGGCCAGGGAGCAGCTGGTG-3'；PI3K上游引物5'-CCACGACCATCATCAGGTGAA-3'，下游引物5'-CCACGACCATCATCAGGTGAA-3'；AKT上游引物5'-TCCTCCTCAAGAATGATGGCA-3'，下游引物5'-GTGCGTTCGATGACAGTGGT-3'；GAPDH上游引物5'-TCAATGTCGGCGCCTATTTC-3'，下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。反應(yīng)條件：90 ℃ 95 s，90 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，70 ℃ 18 s，共40個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，按2-ΔΔCt計算LncRNA OGFRP1、TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 的相對表達(dá)量。根據(jù)EC 組織中LncRNA OGFRP1、TDRG1 的表達(dá)均值將患者分為LncRNA OGFRP1、TDRG1 高表達(dá)者及低表達(dá)者。

1.3 預(yù)后隨訪方法 EC 患者出院后隨訪3 年，隨訪形式為電話或門診，隨訪終止事件為患者死亡或隨訪截止時間（2022 年12 月），統(tǒng)計并計算患者3 年總生存率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行正態(tài)性分析，符合正態(tài)分布的以-x±s表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，數(shù)據(jù)比較行χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)性分析EC 組織中LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 與PI3K mRNA、AKT mRNA 的相關(guān)性；K-M法繪制EC 組織中不同LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 表達(dá)患者的生存曲線，Log-Rank 檢驗分析EC 組織LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系；COX 回歸分析EC 患者預(yù)后的影響因素，取單因素COX 回歸分析結(jié)果P＜0.05 的臨床指標(biāo)進(jìn)一步納入多因素COX 回歸分析，總結(jié)影響EC 患者預(yù)后的獨立危險因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EC 和癌旁組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 表達(dá)比較 EC 及癌旁組織中LncRNA OGFRP1 表達(dá)分別為1.19 ± 0.23、0.56 ±0.13，LncRNA TDRG1 表達(dá)分別為1.35 ± 0.31、0.74 ± 0.19，PI3K mRNA 表達(dá)分別為1.24 ± 0.25、0.80 ± 0.20，AKT mRNA 表達(dá)分別為1.22 ± 0.27、0.89 ± 0.17；EC 組織中LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 表達(dá)均高于癌旁組織（P均＜0.05）。

2.2 EC 組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 與PI3K、AKT mRNA 表達(dá)的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EC 組織中LncRNA OGFRP1 表達(dá)與PI3K、AKT mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.584、0.571，P均＜0.01），LncRNA TDRG1 表達(dá)與PI3K、AKT mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.593、0.584，P均＜0.01）。

2.3 LncRNA OGFRP1、TDRG1 高低表達(dá)EC 患者預(yù)后比較 90 例EC 患者中LncRNA OGFRP1 高表達(dá)47 例、低表達(dá)43 例，LncRNA TDRG1 高表達(dá)45 例、低表達(dá)45 例。至隨訪結(jié)束，90 例EC 患者死亡29 例，3 年總生存率為67.78%。Log-Rank 檢驗顯示，LncRNA OGFRP1 高、低表達(dá)EC 患者3 年總生存率分別為55.32%、81.40%，LncRNA OGFRP1 高表達(dá)EC 患者3 年總生存率低于LncRNA OGFRP1 低表達(dá)患者；LncRNA TDRG1高、低表達(dá)EC 患者3 年總生存率分別為53.33%、82.22%，LncRNA TDRG1 高表達(dá)EC 患者3 年總生存率低于LncRNA TDRG1 低表達(dá)患者（P均＜0.01）。見OSID 碼圖1、2。

2.4 LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達(dá)與EC 患者預(yù)后的關(guān)系 以EC 患者生存狀態(tài)為因變量（死亡=1，存活=0），年齡（≥50 歲=1，＜50 歲=0）、組織學(xué)分型（Ⅱ型=1，Ⅰ型=0）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、FIGO 分期（Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、LncRNA OGFRP1（≥1.19=1，＜1.19=0）、LncRNA TDRG1（≥1.35=1，＜1.35=0）為自變量納入單因素Cox 回歸分析。結(jié)果顯示，分化程度中高分化、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA OGFRP1≥1.19 及LncRNA TDRG1≥1.35 是影響EC 患者預(yù)后的危險因素（P均＜0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，F(xiàn)IGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA OGFRP1≥1.19、LncRNA TDRG1≥1.35為影響EC 患者預(yù)后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 EC患者預(yù)后影響因素的COX回歸分析結(jié)果

3 討論

EC 以陰道不規(guī)則流血、排液為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病可能與遺傳、性激素紊亂、代謝異常、高血壓、雌激素暴露等因素有關(guān)［1］。盡管近年來腹腔鏡手術(shù)、精準(zhǔn)放化療、免疫治療等取得較大進(jìn)展，但仍有很多患者治療效果一般，且獲得性耐藥患者隨著治療時間的延長逐漸增加［8］。因此，深入探索EC 相關(guān)標(biāo)志物，分析EC患者預(yù)后不良的危險因素和分子機(jī)制對于指導(dǎo)臨床治療及改善患者預(yù)后具有積極的意義。

相關(guān)報道表明，表觀遺傳能夠通過影響多種基因表達(dá)參與EC 的發(fā)生發(fā)展［9］。LncRNA 可通過直接與蛋白質(zhì)相互作用、與微小RNA（miRNA）相互作用形成內(nèi)源競爭RNA、編碼蛋白質(zhì)或多肽等多種方式調(diào)控EC 進(jìn)程［2］。CHEN 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA OGFRP1 能通過抑制AKT/mTOR 及Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示LncRNA OGFRP1 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。DONG 等［11］研究顯示，抑制LncRNA OGFRP1 表達(dá)能靶向miR-423-5p/CCCTC軸結(jié)合因子抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的血管生成和上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上述研究均提示，LncRNA OGFRP1 可能是一種促癌基因。同時有研究報道，LncRNA OGFRP1 高表達(dá)還與結(jié)直腸癌［3］、肺腺癌［12］患者的預(yù)后不良有關(guān)。但是關(guān)于LncRNA OGFRP1 與EC 患者預(yù)后的關(guān)系尚未明確。本研究結(jié)果顯示，EC 組織中LncRNA OGFRP1 表達(dá)上調(diào)，且與分化程度、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LncRNA OGFRP1 高表達(dá)參與了EC 進(jìn)程。分析其原因可能為LncRNA OGFRP1 高表達(dá)可靶向miR-124-3p 上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1，促進(jìn)EC 細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)EC 的惡性進(jìn)展［4］。PI3K/AKT 信號通路主要受體酪氨酸激酶激活，上調(diào)PI3K 復(fù)合物活性可導(dǎo)致AKT 激活，AKT 可通過激活mTOR、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等分子，促進(jìn)EC 細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲等生理病理過程［13］。CHEN 等［10］研究報道，LncRNA OGFRP1 參與AKT/mTOR 信號通路調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，EC 組織中LncRNA OGFRP1 與PI3K mRNA、AKT mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，提示LncRNA OGFRP1 高表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路參與EC 進(jìn)展。LV 等［4］研究也表明，LncRNA OGFRP1 高表達(dá)可導(dǎo)致EC 中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路激活，進(jìn)而促進(jìn)EC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

多項研究表明，LncRNA TDRG1 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程［14］。王帥奇等［15］研究報道，敲低LncRNA TDRG1 能夠靶向miR-101-3p 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。LU 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，抑制LncRNA TDRG1 表達(dá)可靶向miR-423-5p/KLF5 信號通路，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲并加速其凋亡。上述研究提示，LncRNA TDRG1 可能也是一種促癌基因。同時，DONG 等［17］通過分析EC 細(xì)胞中的LncRNA 發(fā)現(xiàn)，LncRNA TDRG1 在EC 細(xì)胞中高表達(dá)。有學(xué)者指出，LncRNA TDRG1 高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌［18］、卵巢癌［19］患者的預(yù)后不良有關(guān)，而關(guān)于LncRNA TDRG1 與EC 患者預(yù)后的關(guān)系尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，EC組織中LncRNA TDRG1表達(dá)上調(diào)，與分化程度、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LncRNA TDRG1 高表達(dá)參與EC 進(jìn)程。分析其原因可能為LncRNA TDRG1 高表達(dá)能夠靶向上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A，刺激新生血管生成，從而促進(jìn)EC細(xì)胞增殖和侵襲［6］。本研究結(jié)果顯示，EC組織中LncRNA TDRG1 與PI3K、AKT mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，提示LncRNA TDRG1 高表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路參與EC 進(jìn)展。SUN 等［20］研究也發(fā)現(xiàn)，敲低LncRNA TDRG1 能通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制EC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)其凋亡。

本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)，LncRNA OGFRP1、TDRG1 高表達(dá)的EC 患者的3 年總生存率低于低表達(dá)患者，提示LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達(dá)與EC患者預(yù)后有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA OGFRP1≥1.19、LncRNA TDRG1≥1.35 為影響EC 患者預(yù)后的獨立危險因素，提示LncRNA OGFRP1、TDRG1 升高會增加EC患者死亡風(fēng)險，兩者有望成為輔助評估EC患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。

綜上所述，EC 組織中LncRNA OGFRP1、TDRG1表達(dá)升高，LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達(dá)與PI3K/AKT信號通路相關(guān)分子表達(dá)存在相關(guān)性，且為EC患者預(yù)后不良的獨立危險因素。然而LncRNA OGFRP1、TDRG1表達(dá)通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響預(yù)后的具體分子機(jī)制尚不明確，期待后續(xù)研究進(jìn)一步深入分析。