外源誘導尾葉桉非培養(yǎng)內生細菌的激活*

王亞聰 王 迪 田紅雨 王照玉 史曉夢 冉隆賢,2

（1. 河北農業(yè)大學林學院 保定 071000；2. 河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室 保定 071000）

桉樹（Eucalyptusspp.）為桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）、杯果木屬（Angophora）和傘房屬（Corymbia）植物的統(tǒng)稱，具有速生、適應性和抗逆性強、用途廣等特點，是我國華南地區(qū)營造速生豐產林的主要樹種之一。桉樹原產于澳大利亞、印度尼西亞及其附近島嶼，其引種栽培范圍遍及世界5大洲120多個國家和地區(qū)（王楚彪等，2021）。目前，全球桉樹人工林種植面積超過2 500萬hm2，占世界人工林面積的15%，我國桉樹種植總面積546萬hm2，居世界第3位（彭杏冰等，2021；任世奇等，2021），年產木材5 000萬m3以上，為增加森林資源、緩解我國木材供需矛盾發(fā)揮了重要作用（Wanget al.，2019；竹萬寬等，2020；陳潔純等，2021）。

微生物是地球上多樣性最豐富的生物類群，99%以上的微生物處于存活但非培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)，這種狀態(tài)是非芽孢形成菌抵御不良環(huán)境的生存機制，在現有技術條件下難以分離培養(yǎng)（賀紀正等，2013；Pintoet al，2015；張碩等，2018），但在條件適宜時菌體可以復蘇，能夠恢復其在培養(yǎng)基上生長繁殖的能力（Ayrapetyanet al，2018；闞玉敏等，2020）。植物根、莖、葉、花、果實和種子等組織和器官中普遍存在內生細菌，這些內生細菌同其他環(huán)境中的微生物一樣，因難以模擬其生長繁殖的原位條件大多不能進行純培養(yǎng)（孫磊等，2006；王躍強等，2006）。田紅雨（2020）應用顯微鏡觀察和高通量測序技術在赤桉（E. camaldulensis）、尾葉桉（E. urophylla）和粗皮桉（E. pellita）實生組培苗中均發(fā)現大量非培養(yǎng)內生細菌的存在，且優(yōu)勢菌屬較相似，分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘脂菌屬（Sphingobium）細菌。Podolich等（2009）將熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）接種馬鈴薯（Solanum tuberosum）組培苗，使非培養(yǎng)內生細菌甲基營養(yǎng)菌（Methylobacteriumsp. ）恢復到可培養(yǎng)狀態(tài)。還有研究發(fā)現，在培育植物組培苗的過程中，隨著繼代次數增加，也可出現可培養(yǎng)內生細菌。Thomas等（2008）對香蕉（Musa paradisiaca）莖尖培養(yǎng)繼代后不可培養(yǎng)內生菌逐漸恢復活性變成可培養(yǎng)狀態(tài)。申紅妙等（2010）發(fā)現尾葉桉組培苗中有存活但不可培養(yǎng)的內生細菌，但組培苗繼代培養(yǎng)至第8代后能夠分離到可培養(yǎng)內生細菌。宋艷祥等（2011）利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CN030菌株與桉樹組培苗共培養(yǎng)，分離出至少6種優(yōu)勢的非培養(yǎng)內生細菌。

桉樹青枯病在廣東、廣西和海南等?。▍^(qū)）發(fā)生嚴重，重病區(qū)植株死亡率高達98%，一般流行區(qū)死亡率也達30%～50%（張民興等，1996），給桉樹生產造成極大威脅，成為桉樹行業(yè)亟待解決的問題（Zhouet al.，2011）。Ran等（2005a）研究發(fā)現，應用菌液蘸根法熒光假單胞桿菌 WCS417r對桉樹青枯病具有顯著防治效果，惡臭假單胞桿菌（P. putida）WCS358r對桉樹青枯病具有較好防治作用，但其嗜鐵素缺失突變體完全失去防治效果，而熒光假單胞桿菌WCS374r沒有防治作用；Ran等（2005b）對這些菌株進行誘導抗病性研究得出，WCS358r和WCS374r能夠誘導桉樹抵御青枯病，WCS358r產生的嗜鐵素缺失突變體沒有誘導效果，說明嗜鐵素是WCS358r菌株誘導桉樹抗青枯病的關鍵因子，而WCS374r的嗜鐵素缺失突變體仍具有誘導抗病活性。鑒于此，本研究在利用上述3種細菌對桉樹青枯病進行生物防治和誘導抗病性研究的基礎上，進一步探究這些細菌對桉樹非培養(yǎng)內生細菌的激活作用，以期為應用內生細菌防治桉樹青枯病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 桉樹種子 尾葉桉種子，廣東省雷州林業(yè)局提供，用于培養(yǎng)無菌實生苗。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 尾葉桉無菌實生苗培養(yǎng)選用1/2 MS培養(yǎng)基；細菌培養(yǎng)選用KB培養(yǎng)基。

1.1.3 供試菌株 外源菌株惡臭假單胞桿菌WCS358r和熒光假單胞桿菌WCS374r及其嗜鐵素缺失突變體JM218和Mut2，熒光假單胞桿菌WCS417r及其脂多糖缺失突變體WCS417OA-(B4)，均由荷蘭烏特勒支大學提供。

1.2 尾葉桉無菌實生苗的培養(yǎng)

挑選健康飽滿的尾葉桉種子，在超凈工作臺上依次用75%乙醇消毒30 s、0.1% HgCl2消毒2 min后，用無菌水沖洗3～4次，播種到1/2 MS培養(yǎng)基上，置于25 ℃光暗交替的環(huán)境中培養(yǎng)，成苗后對桉樹苗進行繼代培養(yǎng)，獲得多株同源同代尾葉桉實生苗。

1.3 菌懸液與細菌代謝液的制備

外源菌WCS358r、WCS374r和WCS417r在KB培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)1～2天后，用無菌水將WCS358r配制成103、105、107、108和109CFU·mL-1的菌懸液，將WCS374r、WCS417r配制成108CFU·mL-1的菌懸液，備用。同樣方法將上述3種外源菌的突變體JM218、Mut2和WCS417OA-(B4)用無菌水分別配制成108CFU·mL-1的菌懸液，備用。

1.4 桉樹非培養(yǎng)內生細菌的激活

1.4.1 3種外源菌及其突變體與同源同代桉樹實生苗共培養(yǎng) 選取長勢基本相同的同源同代桉樹實生苗21株。取篩過的河沙12 g于西林瓶中，再將西林瓶置于300 mL組培瓶內，間隔24 h進行2次高溫高壓滅菌，每次滅菌時間1 h。在無菌條件下將桉樹實生苗移栽至裝有無菌河沙的西林瓶內，每瓶1株，處理組分別澆淋4 mL濃度108CFU·mL-1的外源菌或其突變體的菌懸液，對照組澆淋等量無菌水。最后，在組培瓶中加入適量無菌水用于保濕，置于12 h光暗交替的25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4.2 WCS358r與尾葉桉種子實生苗共培養(yǎng) 采用上述同樣方法對過篩河沙進行稱重、裝瓶和滅菌處理，備用。選取由尾葉桉種子無菌萌發(fā)的實生苗4株，編號。無菌條件下將桉樹苗分別移栽至裝有無菌河沙的西林瓶內，每瓶1株，并依照苗號做好標記，分別澆淋4 mL濃度108CFU·mL-1的WCS358r菌懸液，對照組澆淋等量無菌水。同樣向組培瓶中加入適量無菌水并封口后，置于25 ℃、12 h光暗交替環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4.3 不同濃度WCS358r與同源同代桉樹苗共培養(yǎng) 選取長勢基本相同的同源同代尾葉桉實生苗15株。稱取12 g過篩河沙，按照上述同樣方法進行裝瓶和滅菌，備用。在無菌條件下將選取的桉樹實生苗分別移栽至裝有無菌河沙的西林瓶內，每處理3株，分別澆淋4 mL濃度103、105、107和109CFU·mL-1的WCS358r菌懸液，對照組澆淋等量無菌水。組培瓶中加入適量無菌水并封口后，置于25 ℃、12 h光暗交替環(huán)境中培養(yǎng)。

1.5 桉樹非培養(yǎng)內生細菌的分離與純化

1.5.1 非培養(yǎng)內生細菌的分離 外源菌與桉樹苗共培養(yǎng)21 天后，在無菌條件下用無菌水將桉樹苗根部河沙沖洗干凈，并將其分成根、莖、葉3部分，分別稱量并記錄。根、莖、葉分別采用上述方法進行表面消毒，取最后1次沖洗液200 μL涂平板，檢測消毒效果。各部位的桉樹苗材料分別在3個無菌研缽內加入1 mL無菌水研磨成漿，稀釋100倍后，取研磨液200 μL涂平板，置于28 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。對照組桉樹苗也按同樣處理方式，分離非培養(yǎng)內生細菌。

1.5.2 非培養(yǎng)內生細菌的純化 研磨液培養(yǎng)3～7 天后，先依據長出細菌的表面顏色和形態(tài)特征進行初步分類并編號，再將編號后的細菌轉接至新的KB培養(yǎng)基內，28 ℃下純化培養(yǎng)。為避免丟失一些生長較慢的內生細菌，初始分離的培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。

1.6 激活內生細菌的鑒定

1.6.1 抗利福平檢測 所接種的外源菌及其突變體均為經過抗利福平篩選的細菌，能夠在含150 μg·mL-1利福平的培養(yǎng)基上正常生長，因此通過抗利福平試驗，可依據細菌生長情況判定從桉樹植株中分離出來的細菌是否為接種后定殖的外源菌。無菌條件下，在融化的KB培養(yǎng)基中加入無菌利福平母液，搖勻，使利福平在培養(yǎng)基中的濃度為150 μg·mL-1，倒入培養(yǎng)皿內，待其冷卻凝固后，用滅菌牙簽按順序點接標記好的內生細菌菌落于培養(yǎng)基上，并對應標號，置于28 ℃下培養(yǎng)，24 h后觀察點接菌落的生長情況，并以未加利福平的KB培養(yǎng)基作為對照。

1.6.2 革蘭氏染色反應 在超凈工作臺內，用滅菌吸管滴1～2滴3%KOH溶液于干凈的載玻片上，再用接種環(huán)挑取待測細菌單菌落到KOH溶液中并順時針攪拌。如果攪拌液稀薄呈粥樣，不能拉絲則該細菌為革蘭氏陽性菌；如果攪拌液黏稠，拉出細絲則為革蘭氏陰性菌（Suslowet al.，1982）。

1.7 被激活內生細菌的分子鑒定

1.7.1 細菌總DNA提取 將純化的內生細菌再重新培養(yǎng)1～2 天，培養(yǎng)條件同上。參照DNA提取試劑盒說明書分別提取各菌體DNA，取上清液作為DNA模板，備用。

1.7.2 PCR擴增反應 參照PCR擴增細菌16S rDNA試劑盒說明書，采用50 μL 擴增體系，對目的片段進行PCR擴增，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。獲得目的條帶后，對DNA瓊脂糖進行切膠純化。

1.7.3 DNA測序 切膠回收目的片段，以SEQForward、SEQInternal和SEQReverse為引物進行DNA測序。將所測基因序列在NCBI上與已知序列進行BLAST比對，選取相似度較高的序列，使用Mega5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定外源菌激活獲得的非培養(yǎng)內生細菌的分類地位。

1.8 數據分析

利用Excel 2016軟件整理試驗數據，采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析統(tǒng)計各處理平均值的差異，并用Duncan多重比較對所得數據進行差異顯著性檢驗，計算并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同外源菌及其突變體對桉樹苗內生細菌的激活

3種外源菌及其突變體對同源同代桉樹苗進行激活處理后，從WCS358r處理的桉樹苗中共分離純化出3種內生細菌，經抗利福平試驗發(fā)現其中1種優(yōu)勢菌株為接種后定殖在桉樹體內的外源菌WCS358r，其主要定殖在桉樹苗根部，平均定殖量達6.76×106CFU·g-1（表1），另外2種內生細菌為被激活的非培養(yǎng)內生細菌，經染色鑒定均為革蘭氏陽性菌株，分別編號5和6（表2）；從WCS417r處理的桉樹苗中只分離出1種內生細菌，經抗利福平試驗鑒定為接種后定殖在桉樹體內的外源菌WCS417r，其在桉樹根和莖部的定殖量顯著高于葉部（P＜0.05）（圖1）；而接種外源菌WCS374r及其突變體Mut2、WCS358r的嗜鐵素缺少突變體菌株JM218和WCS417r的脂多糖缺失突變體菌株WCS417OA-(B4)后，桉樹苗中均未發(fā)現接種的外源菌，且也未分離出其他細菌，與對照組的桉樹苗相同。

圖1 WCS417r在桉樹各部位的定殖情況Fig. 1 The colonization of WCS417r in E. urophylla

表1 WCS358r在桉樹體內的定殖情況（對數值）Tab. 1 The colonization of WCS358r in E. urophylla(lg CFU·g-1, fresh weight)

表2 WCS358r激活桉樹內生細菌情況（對數值）①Tab. 2 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria by WCS358r in E. urophylla (lg CFU·g-1, fresh weight)

2.2 外源菌WCS358r對尾葉桉不同種子實生苗內生細菌的激活

外源菌WCS358r能成功定殖在桉樹實生苗根、莖部位，定殖量表現為根＞莖（表3），而其激活的桉樹非培養(yǎng)內生細菌主要分布在莖部和葉部，其中苗1中分離出2種桉樹非培養(yǎng)內生細菌，編號為1和2；苗2中分離出2種桉樹非培養(yǎng)內生細菌，編號3和4；苗4中分離出1種桉樹非培養(yǎng)內生細菌，編號為8（表4）。經染色鑒定以上激活出的非培養(yǎng)內生細菌，均為革蘭氏陽性菌株。其他處理后的桉樹苗與對照組桉樹苗均未分離到內生細菌。

表3 WCS358r在不同桉樹實生苗內的定殖情況（對數值）Tab. 3 The colonization of WCS358r in different E. urophylla seedlings (lg CFU·g-1, fresh weight)

表4 WCS358r激活不同桉樹實生苗內生細菌情況（對數值）①Tab. 4 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria by WCS358r in different E. urophylla seedlings(lg CFU·g-1, fresh weight)

2.3 不同濃度WCS358r對桉樹非培養(yǎng)內生細菌的激活

由表5可知，濃度105和107CFU·mL-1的WCS358r處理同源同代桉樹苗后，只在桉樹苗根部分離出1種細菌，經抗利福平試驗鑒定為外源菌WCS358r；濃度為109CFU·mL-1時，從桉樹苗中分離出3種細菌，其中1種細菌經鑒定為外源菌WCS358r，另外2種細菌為非培養(yǎng)內生細菌，編號為5和7（表6），為革蘭氏陽性菌；外源菌濃度為103CFU·mL-1時與對照組均未分離得到內生細菌。

表5 不同濃度WCS358r在桉樹苗內定殖情況（對數值）Tab. 5 The colonization of different suspension of WCS358r in E. urophylla (lg CFU·g-1, fresh weight)

表6 WCS358r濃度為109 CFU·mL-1對桉樹內生細菌的激活情況（對數值）①Tab. 6 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria in E.urophylla by WCS358r at a population density of 109 CFU·mL-1(lg CFU·g-1, fresh weight)

2.4 被激活內生細菌的初步鑒定

2.4.1 抗利福平檢測 從處理后的桉樹體內分離到接種的外源菌株WCS417r和WCS358r，其均可在含150 μL·mL-1利福平的KB培養(yǎng)基上正常生長。從植株中分離出的其余8種細菌對利福平沒有抗性，且顏色和形態(tài)與接種的外源菌也有明顯差異，可判斷為激活的非培養(yǎng)內生細菌，其在不含利福平的KB培養(yǎng)基上的培養(yǎng)狀態(tài)和生長特征如表7和圖2所示。

圖2 被激活內生細菌的菌落形態(tài)Fig. 2 The colony morphology of resuscitated endophytic bacteria in E. urophylla1—8號代表被激活的內生細菌菌株。No.1-8 indicate resuscitated endophytic bacterial strains.

表7 尾葉桉中被激活內生細菌的主要特征Tab. 7 The main characteristics of endophytic bacteria of E. urophylla

2.4.2 革蘭氏染色反應 被激活的1～8號非培養(yǎng)內生細菌，全部為革蘭氏陽性細菌。

2.5 被激活內生細菌的分子鑒定

對8種內生細菌分別提取并擴增DNA后，進行16S rDNA菌種鑒定。將測序結果與NCBI菌種數據庫進行比對，并用Mega5.0軟件進行分析后構建系統(tǒng)進化樹（圖3），初步確定被激活細菌的分類地位：1號與鏈霉菌屬5種菌的同源性均達100%；2號與短小芽孢桿菌的同源性達100%；3號與蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌達100%的同源性；4號與枯草芽孢桿菌、龍舌蘭芽孢桿菌和漠海威芽孢桿菌親緣關系比較近，均達99%的同源性；5、6和8號與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌親緣關系比較近；7號與枯草芽孢桿菌和龍舌蘭芽孢桿菌親緣關系比較近。

圖3 被激活內生細菌系統(tǒng)發(fā)育學地位Fig. 3 The phylogenetic tree of resuscitated endophytic bacteria1—8號代表被激活的內生細菌菌株。No.1-8 indicate resuscitated endophytic bacterial strains.

3 討論

3.1 影響桉樹非培養(yǎng)內生細菌激活能力的因素

在同源同代桉樹苗中接種WCS358r、WCS374r和WCS417r 3種不同外源菌后，其在桉樹體內的定殖能力及對植物非培養(yǎng)內生細菌的激活能力均有差異。在桉樹根、莖和葉中均檢測到大量外源菌株WCS417r，只在根和莖中檢測到外源菌株WCS358r，WCS374r未成功定殖于桉樹任何部位，外源菌株的定殖能力表現為WCS417r＞WCS358r＞WCS374r。Ran等（2005a）選用這3種菌株以蘸根方式進行桉樹青枯病防治試驗，WCS417r的防治效果顯著，WCS358r具有一定生防效果，而WCS374r沒有生防效果，與本試驗的定殖情況具有相似特性，推測生防菌對桉樹青枯病的防治效果可能與其定殖能力有關。本研究還發(fā)現，WCS358r的嗜鐵素缺失突變體JM218未能在同源同代桉樹苗中激活出非培養(yǎng)內生細菌，失去野生型菌株原有的激活能力，WCS417r的脂多糖缺失突變體菌株WCS417OA-(B4)不能定殖于桉樹體內，失去野生型菌株原有的定殖能力，這表明細菌的脂多糖基因會影響細菌的定殖能力，而嗜鐵素基因會影響細菌對桉樹非培養(yǎng)內生細菌的激活能力。

3.2 可被激活的桉樹非培養(yǎng)內生細菌

從桉樹實生組培苗中激活出的非培養(yǎng)內生細菌大多數為芽孢桿菌（Bacillus），少數為鏈霉菌屬（Streptomyces）。目前諸多報道證實芽孢桿菌廣泛存在于許多植物體內，且占比較高，包含枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）和短小芽孢桿菌（B. pumilus）等多種芽孢桿菌（Rangelet al.，2022；Vendanet al.，2010；葛慈斌等，2015；Goulartet al.，2019；龔國利等，2020），因此，使用外源激活菌從桉樹體內激活出非培養(yǎng)內生芽孢桿菌較多可能與其在桉樹內的存在數量有關，但仍需進一步驗證。芽孢桿菌是目前生產上開發(fā)和應用最為成熟的生防菌之一，但除芽孢桿菌外，本研究中還激活出鏈霉菌，有研究表明鏈霉菌在植物病害的生物防治上也具有廣闊應用前景（Kanget al., 2022；Pereiraet al.,2022）。楊鳳環(huán)（2008）研究發(fā)現，內生鏈霉菌CN122對桉樹青枯病菌具有明顯防治效果，但應用內生鏈霉菌防治桉樹青枯病還需進一步探究。

本研究使用外源菌從桉樹組培苗中激活出來的非培養(yǎng)內生細菌全部為革蘭氏陽性菌，宋艷祥（2011）用枯草芽孢桿菌CN030激活桉樹組培苗也出現同樣情況。目前對于VBNC態(tài)細菌恢復培養(yǎng)能力的機制尚不明確，因此對于本研究中出現的這種現象還無法解釋。已知復蘇促進因子（resuscitation promoting factor，Rpf）能夠促進休眠菌的復蘇（Wanget al., 2022），有學者認為Rpf廣泛存在于厚壁菌門的革蘭氏陽性細菌中，參與肽聚糖合成等過程，有的革蘭氏陽性細菌中甚至含有5個Rpf基因，在部分革蘭氏陰性菌中也發(fā)現類似于Rpf的蛋白質，利于細菌的復蘇（張曉華等，2020）。另外，本研究選用的3種外源激活菌均為革蘭氏陰性菌，在之后的研究中可以同時對比革蘭氏陽性菌和陰性菌的激活試驗結果，以深入探究固有內生細菌的激活規(guī)律。

目前，對VBNC態(tài)的細菌進行恢復培養(yǎng)的研究報道很多（Panutdapornet al.，2006；Suet al.，2015；張艷軍等，2020），如有些研究探究吐溫對VBNC菌的復蘇作用（田聰等，2013；Zenget al.，2013；蔣麗芬，2017），今后的研究也可探索更多不同的復蘇刺激因子對桉樹非培養(yǎng)內生細菌的激活作用，為挖掘更多的潛在微生物資源和應用桉樹內生細菌進行青枯病防治提供參考。

4 結論

外源菌的種類、濃度及桉樹種子均會影響桉樹非培養(yǎng)內生細菌的激活情況，被激活的非培養(yǎng)內生細菌全部為革蘭氏陽性菌，且主要為芽孢桿菌。嗜鐵素是惡臭假單胞桿菌WCS358r激活桉樹非培養(yǎng)內生細菌的關鍵因子，脂多糖是影響熒光假單胞桿菌WCS417r定殖的關鍵因子。