脫脂南極磷蝦蛋白質提取條件優化

耿 樂,王洪斌,劉志東,張俊杰,段 蕊,林 娜,倪 玲,遲 海

(1江蘇海洋大學食品科學與工程學院,江蘇 連云港 222005;2中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090)

南極磷蝦(EuphausiasuperbaDana)屬于節肢動物門、甲殼綱、磷蝦目,是一種小型甲殼動物,其生物資源量預計在10億t左右,不僅為南大洋食物網中的關鍵物種而且具備極高的商業價值[1]。南極磷蝦含有豐富的蛋白質,蛋白質濕基含量達11.9%～15.4%[2],干基含量約為70%[3]。其蛋白質含有世界衛生組織/糧農組織/聯合國大學(WHO/FAO/UNU)要求的全部必需氨基酸,所有必需氨基酸含量均高于WHO/FAO/UNU對成人(嬰兒)的要求,有潛力成為人類未來可開發的優質蛋白質資源。

目前針對南極磷蝦蛋白質提取已有較多研究,高飛等[4]優化了南極磷蝦蛋白質提取工藝,得到冷凍南極磷蝦蛋白質的提取條件。廖鄂[5]采用ISP技術提取南極磷蝦蛋白質,通過改進提取條件使蛋白質提取率提升至63%。王靈昭[6]系統研究了堿溶酸沉法提取南極磷蝦蛋白質工藝,并研究了脫氟技術。Chen等[7]采用不同的pH處理,通過溶解/沉淀從整個南極磷蝦中回收蛋白質和不溶物。蛋白質提取率為45% ～ 50%(干基)。以上研究主要是以冷凍南極磷蝦等為原料。Wang等[8]研究了以脫脂南極磷蝦粉為原料提取蛋白質,經過二次提取得到的分離蛋白質最高得率為28.66%,但未對提取條件進行優化,提取時間較長。

因此,針對脫脂南極磷蝦粉的高值化利用研究亟待更加深入地開展。脫脂南極磷蝦粉主要為提取磷蝦油后的副產物,目前主要作為飼料原料,價格低廉且蛋白質含量高[9]。探索一種高附加值的方法來利用這種富含蛋白質的材料已引起研究人員和工業界的廣泛關注[10]。

本研究以脫脂南極磷蝦粉為原料,以蛋白質得率為指標在單因素試驗基礎上對提取時間、提取溫度、NaOH百分比濃度、料液比進行分析,并通過響應面法優化得出提取的最佳參數,以期為脫脂南極磷蝦粉高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂南極磷蝦粉(蛋白質含量不低于75%)于2021年6月購自中水集團遠洋股份有限公司。氫氧化鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);鹽酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);試驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

90-2型定時恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠有限公司);SHJ-4CD數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋(常州市金壇友聯儀器研究所);6200型立式冷凍離心機(日本久保田株式會社);PHS-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠);AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);FreeZone真空冷凍干燥機(美國LABCONCO公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 DAKP提取工藝流程

提取工藝流程參考高飛等方法[4]:脫脂南極磷蝦粉→堿溶→恒溫浸提→回收上清→調節pH→離心→回收沉淀→調節pH至7.0→真空冷凍干燥→DAKP。

1.3.2 單因素試驗

參考Wang等[8]、任憲君等[11]、郭靜等[12]方法進行單因素試驗。以DAKP得率為指標,分別研究堿溶階段NaOH溶液百分比濃度(1%、1.5%、2%、2.5%、3%),提取溫度(60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃),料液比(w/V)(1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20),提取時間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)對DAKP得率的影響,確定較優的提取條件并進一步優化。

蛋白質得率按下式計算:

XDAKP=100%×m/M

(1)

式中:XDAKP表示得率;m表示蛋白質質量(g);M表示脫脂南極磷蝦粉質量(g)。

1.4 響應面優化試驗

因素水平分析見表1。

表1 DAKP提取的因素水平表

基于單因素試驗結果,選擇提取溫度、提取時間、NaOH百分比濃度3個影響較為顯著的因素作為自變量,以蛋白質得率為因變量,采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken 設計模塊進行優化。設計3因素3水平一共17個試驗點的響應面分析試驗。其中12個為析因點,5個為零點。

2 結果與討論

2.1 DAKP提取的單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度DAKP得率的影響

蛋白質在不同溫度下溶解度不同[13],參考任憲君等[11]、郭靜等[12]的研究方法,選擇提取溫度為60 ℃～80 ℃進行試驗。由圖1可見,隨著提取溫度的增加,DAKP得率呈現出先增后減的趨勢。在60 ℃～70 ℃時,蛋白質得率不斷增加,當提取溫度為70 ℃時,蛋白質得率達到最大,提取溫度超過70 ℃,蛋白質得率開始下降。可能是隨著溫度的升高,分子運動增強[14],蛋白質分子的構象發生變化,因此蛋白質能更好地從原料中析出。

圖1 提取溫度對DAKP得率的影響

但隨著溫度的進一步升高,可能會導致蛋白質熱誘導變性或熱誘導凝膠化[15],從而降低蛋白質的溶出,導致蛋白質得率下降,這與孟橋等[16]研究一致。綜合考慮,確定最適提取溫度選為70℃。

2.1.2 料液比對DAKP得率的影響

由圖2可知,蛋白質得率隨著料液比的增大呈現出先增后減的趨勢,圖2表明當料液比在1∶10～1∶15時,蛋白質得率持續增大,在1∶15時蛋白質得率最高;當料液比大于1∶15,蛋白質得率持續下降,在1∶20時達到最低。其原因可能是當料液比過低時,體系的黏度太大,蝦粉分散不均勻,無法使得蛋白質完全溶出,從而導致得率不高[17]。

圖2 料液比對DAKP得率的影響

料液比過高時,DAKP在體系中過于分散,溶液百分比濃度得到稀釋,使得有效組分含量低,粒子之間無法充分接觸,溶解難度增加,致使蛋白質得率降低。這與趙節昌[18]、Moncef等[19]的結論相似,他們發現料液比增加到一定值,蛋白質產率會增加,隨著比例增大,產率下降。綜合考慮,最適料液比為1∶15。

2.1.3 提取時間對DAKP得率的影響

由圖3可知,隨著提取時間的增加,蛋白質得率呈現先增后減趨勢。

圖3 提取時間對DAKP得率的影響

提取時間在30～60 min時,蛋白質得率逐漸增加,在60 min時,蛋白質得率達到最大。提取時間在60～90 min時,蛋白質得率逐漸降低。30 min時蛋白質得率低的原因可能是由于提取時間太短,物料沒有充分混勻,蛋白質沒有完全溶出,導致蛋白質得率低。60 min后蛋白質得率下降的原因可能是提取時間過長造成蛋白質在堿性條件下浸泡時間過長,空間結構被破壞[20],部分蛋白質發生變性凝聚反應[24],導致得率下降。所以,總體呈現出先增加后減少的趨勢,這與周麗卿等[21]研究結果一致。綜合考慮最適提取時間為60 min。

2.1.4 NaOH百分比濃度對DAKP得率的影響

由圖4可知,DAKP的得率隨著NaOH百分比濃度的增加呈現出先增后減的趨勢。

圖4 NaOH百分比濃度對DAKP得率的影響

當NaOH百分比濃度小于2%時,隨著百分比濃度的增加,蛋白質得率不斷增長,在百分比濃度達到2%時,蛋白質得率達到最大。當NaOH百分比濃度大于2%,蛋白質得率開始下降。原因可能是隨著pH增加,堿性環境會改變蛋白質結構,使其疏松,組成氨基酸之間發生了更高的靜電斥力,導致蛋白質在堿性介質中的溶解度更高[22,23-24],所以蛋白質得率呈現出上升趨勢。堿溶時適當增加堿液百分比濃度會使蛋白質得率得到提升,但過高的pH不僅會使蛋白質分子間難以聚合,且過高堿百分比濃度會加快美拉德反應的進行從而使蛋白質得率下降[25],與王立等[26]研究結果一致。因此NaOH溶液最適百分比濃度選為2%。

2.2 響應面模型的建立及結果

2.2.1 響應面的建模及顯著性檢驗

根據單因素試驗結果,通過響應面法中的Box-Behnken試驗設計對DAKP提取工藝進行優化。以A(提取溫度℃)、B (NaOH百分比濃度%)、C(提取時間min)為自變量,以蛋白質得率作為因變量,進行3因素3水平Box-Behnken響應面優化試驗,得到表2所示結果。

表2 響應面試驗設計與結果

采用Design-Expert.8.0.6,得到DAKP得率對提取溫度、NaOH百分比濃度,提取時間的二次多項回歸模型:DAKP得率=31.94-1.19A+2.49B+0.70C+0.12 AB+0.050AC-0.30BC-5.2 A2-5.86B2-1.78C2。

為了驗證模型的可信度,針對該回歸模型及回歸方程進行誤差統計分析,對方差、可信度、多元相關系數進行計算,得到如表3所示結果。模型P<0.000 1說明模型極顯著,代表選取的各個條件對DAKP得率影響極顯著,失擬項P>0.05不顯著,說明模型正確且穩定,可以用來預測DAKP提取工藝參數。F值表示的是單因素對DAKP得率的影響程度,F值越大,影響越顯著[27]。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

由3個因素F值大小可以看出其對蛋白質得率的影響排序為B>A>C,且均為差異極顯著(P<0.01),AB、AC、BC對蛋白質得率沒有顯著影響(P>0.05),A2、B2、C2對蛋白質得率極顯著(P<0.01)。

表4 回歸方程可信度分析

2.2.2 響應曲面分析

提取溫度、NaOH百分比濃度、提取時間三因素交互作用對DAKP得率的影響如圖5～10所示,三維響應面和二維等高線圖是回歸方程的圖形表示。它們展示了兩個被測變量之間的相互作用類型,以及每個變量的響應與試驗水平之間的關系[28]。等高線的形狀可以反映各個因素之間的交互是否顯著,橢圓表示兩因素之間的交互作用顯著,圓形表示兩因素之間的交互作用不顯著,響應面越彎曲表明此因素對結果影響越大[29-30]。

圖5 提取溫度與NaOH百分比濃度影響DAKP得率的等高線圖

圖5等高線圖呈現圓形,表明提取溫度與NaOH百分比濃度之間交互作用不顯著,與表3顯著性分析結果一致(P>0.05)。

圖6三維響應面圖可知,隨著提取溫度的增加、NaOH百分比濃度的增大,DAKP得率都呈現出先增后減的趨勢,在提取溫度70℃左右,NaOH百分比濃度在2.0%～2.5%之間蛋白質得率最大。這與賀瑩[31]研究的溫度與pH的交互作用對蛋白質提取量的影響趨勢一致。

圖6 提取溫度與NaOH百分比濃度影響DAKP得率的響應面圖

圖7等高線圖為圓形,表示提取溫度與提取時間之間交互作用不顯著,與表3顯著性分析結果一致(P>0.05)。圖8可知隨著提取溫度、提取時間的增加,蛋白質得率先增大后減小。得率最大值出現在提取溫度為70℃左右,提取時間在60～70 min。這與侯召華等[32]研究的溫度與時間的交互作用對蛋白質提取率的影響變化趨勢一致。

圖7 提取溫度與提取時間影響DAKP得率的等高線圖

圖8 提取溫度與提取時間影響DAKP得率的響應面圖

圖9圓形等高線圖表明,提取時間、NaOH百分比濃度之間的交互作用對響應值影響不顯著,符合表3的顯著性分析結果(P>0.05)。由圖10三維響應面圖可知,隨著NaOH百分比濃度、提取時間的增加,蛋白質得率同樣呈現出先增后減的趨勢,蛋白質得率最大值出現在NaOH百分比濃度2.0%～2.5%。提取時間在60～70 min。在這兩個因素交互作用下對得率的影響趨勢與趙海霞等[33]研究的結果一致。

圖9 NaOH百分比濃度與提取時間影響DAKP得率的等高線圖

圖10 NaOH百分比濃度與提取時間影響DAKP得率的響應面圖

2.3 模型的優化與驗證

通過Design-Expert 8.0.6軟件對提取條件進行優化,結果為提取溫度68.90 ℃,NaOH百分比濃度為2.21%,提取時間為65.29 min,此時DAKP理論得率為32.32%。為了驗證回歸方程預測結果的可靠性,需要在上述研究得到的最佳提取條件(提取溫度68.90℃、NaOH百分比濃度為2.21%、提取時間為65.29 min)下試驗進行驗證[34]。考慮到實際操作的可行性,將提取條件調整為提取溫度69℃,NaOH百分比濃度為2.2%,提取時間為65 min,重復試驗3次,實際得率為31.93%±0.35%,與理論值32.32%的相對誤差為1.19%±1.01%,表明該模型對最優工藝的預測是可行的。

2.4 討論

本研究的實際得率為31.93%±0.35%,要高于Wang等[8]的得率(28.66%),且本研究的提取工藝更為便捷,提取時間從其100 min減少到65 min;也高于高飛等[4]研究的南極磷蝦蛋白質得率(10.91%),有很大可能與兩者之間所用原料及提取條件不同有關。從試驗結果來看,提取時間、提取溫度、NaOH百分比濃度對蛋白質得率有較大影響,由響應面圖的趨勢可知,影響大小依次為NaOH百分比濃度>提取溫度>提取時間。因南極磷蝦蛋白質提取優化報道較少,與同為水產研究的候召華等[32]的各影響力大小一致。本研究的優點在于以低附加值的脫脂南極磷蝦粉為原料提取蛋白質,有利于提高其附加值,充分利用南極磷蝦這一寶貴資源,且相較于其他同類研究,蛋白質得率高、易操作、耗時短,有利于進行規模化生產。但仍有改進之處,比如將一次提取改為二次提取,進一步提高得率,以及環境友好地處理產生的廢液。

3 結論

以脫脂南極磷蝦粉為原料,NaOH溶液作為堿溶溶液,通過單因素法與響應面優化試驗得到了堿溶酸沉法提取DAKP的最優條件。考慮實際可操作性,確定最優提取條件為堿溶溶液NaOH百分比濃度為2.2%,提取溫度為69℃,提取時間為65 min,料液比為1∶15,此條件下得到的DAKP得率為31.93%±0.35%,與理論值32.32%的相對誤差為1.19%±1.01%,且操作便捷。相較于其他脫脂南極磷蝦蛋白質提取方法,本研究提取所需時間更短,更有利于規模化生產。期望本研究能促進南極磷蝦附加值相關研究,推動南極磷蝦產業的可持續發展。