四川爐霍縣牦牛源蜱種類的形態學及分子生物學鑒定

洛絨鄧珠，藍 嵐，向 陽，潘 瑤，郝力力

（1.甘孜藏族自治州畜牧業科學研究所，四川 康定 626000；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；3.四川省鹽亭縣高端人才服務中心，四川 鹽亭 621600）

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2021年3月～2021年8月，分別在爐霍縣雅德鄉、斯木鄉、仁達鄉、旦都鄉、泥巴鄉和宜木鄉6個鄉的416頭牦牛體表采集蜱。在各鄉選3～4個村，各村選2～4個農場，從每頭牦牛的體表采集5～6 只蜱。按照地點編號分別裝入采集管中，塞入潮濕脫脂棉，經形態學鑒定后將蜱浸于75%乙醇溶液，置4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：組織基因組DNA提 取 試 劑 盒（EasyPure Genomic DNA Kit）、Trans 2K DNA Marker、1×TAE 溶液和瓊脂糖購自北京全式金公司，1.1×T3 Super PCR Mix購自北京擎科生物有限公司；引物合成與測序均由生工生物工程（成都）有限公司完成。儀器：德國徠卡體式顯微鏡（Leica S9D），多功能生物樣品均質器（Bertin Precelly 24），賽默飛微量離心機（Pico 17），德國耶拿Biometra TRIO 三槽PCR 儀（Biometra TRIO 48），北京六一儀器廠電泳儀（DYY-6C），全自動數碼凝膠圖像分析系統（Tanon 5200 Multi）。

1.3 蜱形態學鑒定 根據《中國畜禽寄生蟲形態分類圖譜》［1］，在體視顯微鏡下觀察蜱形態特征并拍照保存。

1.4 DNA提取 取出保存在75%乙醇溶液中的蜱，用無菌去離子水沖洗3 次。待干燥后沿蜱縱向中軸線切為兩半，分別裝入兩支1.5 mL EP 管中，一支置于－80 ℃冰箱凍存，一支加入500 μL無菌水用多功能生物樣品均質器充分研磨。研磨程序如下：每管加入陶瓷珠（直徑0.5 mm 的20 珠和2 mm 的5 珠），5 500 g 研磨2 次，4 000 g 研磨1 次。取 研 磨 液200 μL，根 據EasyPure Genomic DNA Kit 試劑盒說明書提取蜱基因組DNA，－20 ℃保存備用。

1.5 PCR 檢測 參照Abdullah 等［2］報道的方法對蜱進行分子鑒定，引物信息見表1。PCR 擴增體系如下：模板1 μL，上游、下游引物各1 μL（10 μmol/L），2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，充分混勻。設陽性對照和陰性對照（去離子水）。蜱ITS2基因的擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，共40 個循環；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫。

表1 PCR引物

1.6 序列分析及統計分析 將全部陽性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，使用DNAStar 軟件對所得全部序列進行拼接分析，在NCBI網站中使用BLAST比對，再使用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining 法（Bootstrap 值為1 000）構建分子進化樹，并用SPSS 20.0 軟件對數據進行統計學分析（P＜0.05 表示差異具有統計學意義）。

2 結果

2.1 樣本采集數量及形態學鑒定 經初步鑒定，在爐霍縣的6 個采集點共鑒定出2 種蜱，即微小扇頭蜱與青海血蜱。其中，微小扇頭蜱791只，占96.5%，為優勢種；青海血蜱29只，占3.5%。在仁達鄉、斯木鄉、宜木鄉、泥巴鄉這4 個采集點只采集到微小扇頭蜱；在旦都鄉和雅德鄉則采集到這兩種蜱。結果詳見表2。

2.2 蜱的分子鑒定

2.2.1 蜱ITS2 基因擴增 以1.4 中提取的DNA為模板，采用常規PCR方法擴增蜱的ITS2基因片段，結果顯示在1 600 bp左右處出現條帶，與預期片段大小相符（圖1）。

圖1 蜱ITS2基因的PCR擴增結果（部分樣本）

2.2.2ITS2 基因遺傳進化分析 將測序所得的全部序列進行拼接、比對后共得到19條不同的序列，其中5 條為青海血蜱（H.qinghaiensisLuhuo 1-4），其余14 條為微小扇頭蜱（R.microplusLuhuo 1-14）。選取經BLAST比對后同源性最高的1～2條序列確定種，顯示為青海血蜱及微小扇頭蜱；在NCBI 中選取分離自不同地區的青海血蜱和微小扇頭蜱的ITS2基因序列，選取其他幾個種的血蜱和革蜱的ITS2基因序列作為參考序列，構建分子進化樹（如圖2和圖3所示）。本研究所得的5 條青海血蜱序列均與甘肅平涼（JQ737119）、青海省（JQ737115）H.qinghaiensis的親緣關系最近，并聚于一大支，相似性在97.4%～97.6%。

圖2 ITS2基因構建青海血蜱進化樹

圖3 ITS2基因構建微小扇頭蜱進化樹

R.microplusLuhuo1-14 的相似性在97.6%以上，其差異在0.1%～2.3%。進化分析顯示14 條序列均與微小扇頭蜱的親緣關系最近，聚于一支，相似性在99.2%～100%。其中，R.microplusLuhuo2 與貴州（JQ737125）分離到的微小扇頭蜱的親緣性最高，為100%；R.microplusLuhuo12 與湖南湘西（MK224585）分離到的微小扇頭蜱的同源性最低，為99.2%。

3 討論

形態學鑒定要求鑒定人員的專業能力較強、工作經驗豐富，如蜱存在肢體不完整或外形極為相似的情況，則較難鑒定［3-4］。在寄生蟲的分子鑒定方法中，當前最為常用的是RCR 和DNA 測序。自2003 年Hebert 等提出DNA 分類學可用于物種鑒定以來，DNA 條形碼技術得到了迅速發展，目前已被廣泛應用于寄生蟲的鑒定［5-6］。

本研究僅鑒定出2 種蜱，即微小扇頭蜱和青海血蜱，這可能與本次收集蜱的方法、宿主及收集蜱的地理位置有關。本研究中微小扇頭蜱的占比高達96.5%，為爐霍縣半農牧地區的優勢蜱種，可能是體表采集這種方式及微小扇頭蜱本身的生活史導致的，因為它是典型的一宿主蜱，幼蟲、若蟲、成蟲各階段均在一個宿主上生長發育，只有飽血后的成蟲才會離開宿主，并且它的主要生活環境也是以農區為主。6個采樣點均屬于半農牧地區，地理位置均分布在鮮水河沿線兩岸，故農牧民的放牧區域主要集中于沿河流域的草地、農區等，此類地區均為蜱類適宜生存的地區。本研究中青海血蜱的占比較少，僅為3.5%，僅在雅德鄉、旦都鄉有檢出，這可能和采集方法、宿主有關系，因其為三宿主蜱，在幼蟲階段、若蟲階段、成蟲階段吸飽血后都會脫落，其生活史中九成時間都屬于非寄生階段。非寄生階段的蜱棲息于草原、森林等環境中。

本研究樣本僅在牦牛的體表采集，今后可以采用其他方法如布旗法，或者擴展被采集樣本的宿主種類，如犏牛、藏綿羊等，以進一步了解爐霍縣分布的蜱種類。另外，不同種類的蜱賴以生存的環境條件有所差異，如海拔高度、季節時間、植被類型等。爐霍縣境內平均海拔有3 860 m，而青海血蜱恰是在高山地區分布的高原特有種。

4 結論

截至目前，共檢測出2 種蜱，證明爐霍縣至少存在微小扇頭蜱和青海血蜱。共采集到成蜱820 只，其中青海血蜱29 只，占3.5%；微小扇頭蜱791只，占96.5%，為優勢種。微小扇頭蜱為爐霍半農牧地區的優勢蜱種，在采樣的6 個半農牧鄉均有分布。青海血蜱僅存在于雅德鄉和旦都鄉。