藏獸醫藥用植物與抗生素聯用對致病性大腸桿菌抑菌活性的研究

楊丹嬌，張 敏，吳建平，藍 嵐*，潘 瑤，劉怡雯，陳朝喜，葉忠明

（1.甘孜藏族自治州畜牧業科學研究所，四川 康定 626000；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

在川西北高原牧區，廣大牧民和獸醫人員結合藏獸醫藥用植物資源優勢總結和驗證了一些藏獸醫驗方和偏方，在防治畜禽細菌傳染病等方面具有積極作用［1-2］。基于此，筆者將61種常用藏獸醫藥用植物水提物與臨床常用的抗菌藥物聯用，研究其對藏豬源致病性大腸桿菌的體外抑菌活性，以期為創制綠色中藏獸藥提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 藏獸醫藥用植物和菌株的來源 61 種藏獸醫藥用植物（包括26個科55個屬）采自甘孜藏族自治州不同地區，由西南民族大學獸醫藥理學與毒理學實驗室陳朝喜副教授鑒定，藥物標本編號后保存于該實驗室。藥物敏感性試驗使用的質控菌株ATCC25922也由該實驗室保存。

1.2 抗菌藥物、培養基和化學試劑 四環素（TET）、鏈霉素（STR）、氟苯尼考（FLR）、恩諾沙星（ENR）、氨芐西林（AMP）5 種抗菌藥物購自上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆（TSB）肉湯、麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術有限公司，MH 肉湯、MH 瓊脂購自青島海博生物技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO）等主要化學試劑均為分析純級別。

1.3 61 種藏獸醫藥用植物水提物的制備 采集61種藏獸醫藥用植物置于通風處自然風干，粉碎后過60 目藥典篩，分別取一定重量的粉末按1∶10的比例加入滅菌水浸泡30 min后煎煮1 h，雙層紗布過濾后將濾液濃縮、冷凍干燥，－20 ℃保存。臨用前，準確稱取凍干粉，用滅菌水或DMSO溶解后制成1 g/mL的母液，－4 ℃保存備用。

1.4 致病性大腸桿菌SCP-ExP-coli2017-4307株的分離與鑒定 大腸桿菌SCP-ExP-coli2017-4307 株分離自稻城縣某藏豬原種場的腹瀉糞便樣本。首先利用麥康凱培養基和伊紅美蘭培養基交叉傳代后初步鑒定，然后采用PCR 擴增16S rDNA 進行分子生物學鑒定，通過腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管（15e）進行生化鑒定，確定為大腸桿菌后將純化菌株用30%甘油于低溫下保存。

1.5 藥物敏感性試驗 參照文獻［3］方法略作改動：在96孔板的第1～12列加入100 μL MH肉湯，然后在第1 列加入已配制好的水提物母液100 μL作倍比稀釋，最后1列作為空白對照，每藥兩次重復。挑取生長良好的中等大小菌落于MH肉湯中恒溫靜置培養12～16 h，調整到0.5 麥氏濁度，菌液稀釋后加入100 μL 菌液至96 孔板1～11 列。37℃恒溫培養12～16h，觀察并記錄結果。采用同樣方法測定ATCC25922 和SCP-ExP-coli2017-4307株對四環素、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和氨芐西林的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。

1.6 聯合藥敏試驗 采用棋盤法進行聯合藥敏試驗［4-5］，以部分抑菌濃度（Fractional Inhibitory Concentration，FIC）評價61 種藏獸醫藥用植物水提物與抗菌藥物聯用對SCP-ExP-coli2017-4307 株的抑制作用。當FIC≤0.5 時表示協同作用；0.5＜FIC≤1 時表示相加作用；1＜FIC≤2 時表示無關作用；FIC＞2時表示拮抗作用。

2 結果

2.1 61 種藏獸醫藥用植物水提物對SCP-ExPcoli2017-4307 株的抗菌效果評價 61 種藏獸醫藥用植物水提物對SCP-ExP-coli2017-4307 株的MIC值分布見圖1和表1。

表1 61種藏獸醫藥用植物和5種抗菌藥物對SCP-ExP-coli 2017-4307株的MIC值

圖1 61種藏獸醫藥用植物水提物對SCP-ExP-coli 2017-4307株的MIC值分布

川西獐牙菜、大托葉云實、牛尾蒿、烏奴龍膽、角茴香、角蒿、沙棘、乳白香青、秦艽、唐古特烏頭、喜馬拉雅紫茉莉、藏茴香12 種藥用植物對SCPExP-coli2017-4307株的MIC值為15.625 mg/mL；山苦荬、止瀉木、水柏枝、川西小黃菊、甘青青蘭、甘青瑞香、紅花綠絨蒿、異葉青蘭、芫荽、垂頭菊、兔耳草、草木犀、砂生槐子、點地梅、珠芽蓼、烈香杜鵑、臭蒿、高山繡線菊、高原毛莨、唐古特鐵線蓮、藏紫草、匙葉翼首草22 種藥用植物對SCPExP-coli2017-4307 株的MIC 值為31.25 mg/mL；白苞筋骨草、肉果草、黃帚橐吾、瑞香狼毒、褐毛橐吾、螃蟹甲6 種藏獸醫藥用植物的MIC 值為62.5 mg/mL；大籽蒿、山礬、灰枝紫菀、花錨、白花刺參、草玉梅、夏至草、鐮形棘豆、濕生扁蕾、錫金報春、褐毛風毛菊、藏黨參12種藥用植物對SCPExP-coli2017-4307株的MIC值為125 mg/mL；手參、高原蚤綴、纖毛婆婆鈉、紫花黃華4 種藥用植物對SCP-ExP-coli2017-4307 株的MIC 值為250 mg/mL；白花油麻藤、假耬斗菜、綿參、斑唇馬先蒿、臘腸果5 種藥用植物對SCP-ExP-coli2017-4307株的MIC值≥500 mg/mL。

2.2 61 種藏獸醫藥用植物水提物和抗菌藥物聯用的效果評價 61種藏獸醫藥用植物水提物與5種抗菌藥物聯用對SCP-ExP-coli2017-4307 株的FIC 值見表2。由表2 可知，61 種藥用植物與5種不同種類抗菌藥物聯用未表現出協同作用；61 種藥用植物與氟苯尼考、恩諾沙星聯用均表現出無關或拮抗作用；垂頭菊、臭蒿、藏紫草與四環素聯用表現出相加作用，其余58 種藥用植物表現出無關或拮抗作用；大籽蒿、川西小黃菊、手參、紅花綠絨蒿、芫荽、花錨、垂頭菊、豬牙蓼、臭蒿、高山繡線菊、唐古特鐵線蓮、紫花黃華、褐毛風毛菊、藏紫草、錫金報春15 種藥用植物與鏈霉素聯用表現出相加作用，其余46種藥用植物表現出無關或拮抗作用；止瀉木、川西小黃菊、手參、白苞筋骨草、垂頭菊、豬牙蓼、高山繡線菊、唐古特鐵線蓮、紫花黃華、藏紫草、錫金報春11 種藥用植物與氨芐西林聯用表現出相加作用，其余50 種藥用植物表現出無關或拮抗作用。

表2 61種藏獸醫藥用植物和5種抗菌藥物聯用對SCP-ExP-coli 2017-4307株的FIC值

3 結論

本研究對采自折多山至康定機場沿線路段的61 種代表性藏獸醫藥用植物水提物進行抗菌活性評價，結果顯示55.74%（34/61）的藥用植物對致病性大腸桿菌SCP-ExP-coli2017-4307株表現出較強的體外抗菌活性（MIC≤31.25 mg/mL）。其中，大托葉云實、川西獐牙菜、牛尾蒿、烏奴龍膽、角茴香、角蒿、沙棘、乳白香青、秦艽、唐古特烏頭、喜馬拉雅紫茉莉、藏茴香12 種藥用植物的MIC 值為15.625 mg/mL，提示這些藥用植物在一定程度上可以作為替代抗菌藥物的候選目標。

此外，本研究還初步探討和比較了61種藏獸醫藥用植物與5種常用抗菌藥物聯合應用的藥效學差異。結果表明，白苞筋骨草、垂頭菊、臭蒿、川西小黃菊、大籽蒿、手參、紅花綠絨蒿、芫荽、花錨、高山繡線菊、唐古特鐵線蓮、紫花黃華、褐毛風毛菊、錫金報春、止瀉木、川西小黃菊、藏紫草、豬牙蓼18種藏獸醫藥用植物水提物與四環素、鏈霉素、氨芐西林聯合應用對致病性大腸桿菌SCPExP-coli2017-4307 株表現出相加作用，其中以垂頭菊和藏紫草的相加作用最為廣泛。在后續研究中，可以重點關注垂頭菊和藏紫草的資源分布，并對其不同提取部位進行抗菌活性物質分析和抗菌機制探討。