淫羊藿多糖對牛冷凍精液的影響

苗耀天，馬 強，張 晉，曹振卿，董 偉

（1.武威市畜牧獸醫總站，甘肅武威 733000；2.甘肅省家畜繁育改良管理站，甘肅武威 733000；3.武威市畜牧獸醫科學研究院，甘肅武威 733000 ）

淫羊藿是中國常見傳統補陽藥，具有補腎助陽的功效。藥理研究表明，淫羊藿多糖有多種生物活性，具有抗氧化、增強機體生殖能力等功能[1]。淫羊藿是常見中藥材，生長于海拔1560～3100m 高度的山地，主要產于山西、陜西北部和甘肅東南部。多糖是淫羊藿的主要活性成分，不同形式的淫羊藿多糖在調節機體的各種生理病理途徑中發揮了獨特的生物學功能[2]。有研究指出，淫羊藿多糖能夠在精子抗氧化和調節機體生殖功能中發揮作用[3]。牛冷凍精液是一項非常完善的技術，然而在低溫保存精液的過程中，精子的活力、生存能力和受精率在相當大的程度上受到損害。已有研究表明，在稀釋液的配制過程中，用具有抗氧化作用的中藥有效成分來取代抗生素，可以在殺菌的同時抑制精子冷凍時的抗氧作用[4]。本研究旨在分離純化淫羊藿有效成分淫羊藿多糖，并評估淫羊藿多糖對牛精子冷凍效果的影響，以及對牛精子膜完整性、活力和人工授精受胎率的影響。

1 試驗材料

1.1 儀器

電熱套（國華電器有限公司），冷凝回流裝置（國華電器有限公司），層析柱，BSZ-160 自動部分收集器；實驗室專用超純水機CREAT，SHZ循環水真空泵，精子密度儀、顯微鏡、冷凍程控儀和封裝打印機等冷凍精液設備，液氮罐和液氮由甘肅家畜繁育改良管理站提供；人工授精母牛，配種設備由武威市涼州區城西肉牛專業養殖合作社提供。2kg 淫羊藿購自武威市同仁堂藥店。

1.2 試劑

主要試劑：95%乙醇、正丁醇、氯仿、苯酚、濃硫酸、考馬斯亮藍、葡萄糖標準品、牛血清蛋白標準品和稀釋液等，由甘肅省家畜繁育改良管理站提供。

2 方法

2.1 淫羊藿多糖的提取

2.1.1 打粉取藥店購買的淫羊藿2kg，制成淫羊藿粉末，裝入雙層紗布藥袋，扎牢袋口。

2.1.2 除雜、水提醇沉

加入95%的乙醇沒過淫羊藿粉末，170℃煮沸2～3h，重復多次直至煮出液顏色明顯變淺。將干燥后濾出的淫羊藿粉末用雙蒸水煮沸，2～3h 濾出淫羊藿粉末，重復多次直至煮出液顏色變為茶色，最后將所有煮出液濃縮至1L，待其冷卻后，添加95%的乙醇沉淀并過夜，得到粗多糖。

2.2 淫羊藿粗多糖的分離純化

2.2.1 Sevage 法脫蛋白

用正丁醇和氯仿反復沉淀離心除去蛋白，分液漏斗濾去有機溶劑，重復多次直至沒有沉淀生成。95%乙醇沉淀過夜，得到去完蛋白雜質的淫羊藿粗多糖。

2.2.2 DEAE Fast Flow 柱層析

采用280mL 柱床體積的層析柱，稱取6g 淫羊藿粗多糖溶于60mL 蒸餾水里，充分攪拌。

（1）裝柱

旋緊層析柱的下方，使其呈單向封閉狀態，向柱內注入約1/4 柱體積的蒸餾水。反復混勻填料,并緩慢倒入柱內，待其自然沉降。沉降過夜后打開出水口，調節流速，等到液面降至膠面2～3cm 時，再旋緊層析柱下方關閉出水口，繼續添加填料，重復上述操作直至填料體積到達層析柱體積的85%，在整個灌注過程中保證膠的均勻，膠內無氣泡，若存在氣泡或者紋路則重新裝柱。

（2）平衡

旋緊層析柱上下進出水口，再將上方進水口導管插入蒸餾水中，使流速保持在適當的范圍內，均衡約3 個層析柱的柱床體積。

（3）上樣

將層析柱進水口導管從蒸餾水中取出，待柱內蒸餾水流至膠表面，用50mL 注射器加入1/20柱體積的配制好的淫羊藿粗多糖溶液，沿層析柱管壁緩慢勻速加入多糖樣品，調整液體流速為0.5mL/min，組份收集器的轉速為8min/ 管，采取苯酚硫酸法，對糖進行實時檢測，在490nm 下測定各個收集管的吸光度。描繪洗脫曲線，將吸收峰一樣的洗脫液合并在到一起，待多糖溶液全部流入膠體，用注射器加蒸餾水至距離進水口約3cm，旋緊進水口，繼續將進水口導管插入蒸餾水中。

（4）洗脫

用蒸餾水洗脫，控制液體流速5s/ 滴，洗脫3個柱床體積。

（5）再生

采用堿-酸-堿的方式去除DEAE 離子交換柱上的雜質，將填料從柱子上取出后，①置于0.5mol/L 的氫氧化鈉溶液中浸泡半個小時，半小時后使用蒸餾水反復抽濾清洗，直到pH 接近7。②接著應用事先配制好的0.5mol/L 的鹽酸水溶液浸泡30min，用蒸餾水反復抽濾清洗直到pH 接近7。重復①，清洗后儲存于70%乙醇中。

2.3 淫羊藿多糖的測定

2.3.1 溶液的制備

配5%苯酚、0.08mg/mL 葡萄糖標準品、50μg/mL 粗多糖溶液。

2.3.2 硫酸苯酚法繪制標準曲線

將0.08mg/mL 葡萄糖標準品，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 和0.8mL 配制的葡萄糖標準品，用雙蒸水補足至2mL，加入1mL 的苯酚，5mL 的濃硫酸；等到溶液冷卻后，在OD490處測定其吸光度。標準曲線圖以葡萄糖濃度為水平軸，490nm 處的吸光度為垂直軸繪制。

2.3.3 粗多糖中糖含量測定

取1mL 配制的50μg/mL 淫羊藿粗多糖液與1mL 雙蒸水混合。向混合液中加5%的苯酚1mL后，再加濃硫酸5mL。等待溶液冷卻后，在OD490 處測定吸光度，將所得的結果代入標準曲線，求得淫羊藿粗多糖中糖含量。

2.4 淫羊藿多糖中蛋白質含量的測定

2.4.1 溶液的制備

配制0.05mg/mL 牛血清白蛋白標準品液、100μg/mL 淫羊藿粗多糖溶液。

2.4.2 考馬斯亮藍法繪制蛋白質標準曲線

將0.05mg/mL 牛血清白蛋白標準品，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 和0.8mL 配制的葡萄糖標準品，用雙蒸水補足至1mL，加入5mL考馬斯亮藍，在OD595 處測定吸光度。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標（X），垂直軸為595nm 處吸收（Y）的回歸方程，繪制標準曲線。

2.4.3 粗多糖中蛋白含量測定

取1mL 的100μg/mL 淫羊藿粗多糖溶液加入5mL 考馬斯亮藍，在OD595 處測定吸光度。結果代入標準曲線，求得淫羊藿粗多糖中蛋白質含量。

2.5 含淫羊藿多糖的牛凍精制作

2.5.1 淫羊藿多糖稀釋液制備

用超純水配制含淫羊藿多糖濃度分別為8、4、2、0mg/mL（對照組）成 品Optidyl 稀釋液（購自法國CRYO-VET 公司）各500mL。淫羊藿多糖組分EPs-1 和EPs-2 相對分子質量為81.64×103、60.53×103，本文淫羊藿多糖相對分子質量取兩組分平均值71.08×103[5]。

2.5.2 牛凍精制作

西蒙塔爾種公牛精液采集、活力檢測、密度測量、封裝冷凍和存儲嚴格按照《牛冷凍精液生產技術規程》（NY/T 1234—2018）的要求執行。取10 頭西蒙塔爾種牛精液，稱重測量體積，每份精液用移液槍均分為5 等份，分別對應2.5.1中不同多糖濃度稀釋液稀釋，封裝冷凍后檢測凍精活力和畸形率，每種濃度制作凍精數量1000支。

2.5.3 凍精質量檢測

將冷凍后凍精置于40℃溫水中解凍15s，剪去兩端封口滴入蓋玻片，400 倍顯微鏡下檢測活力；解凍凍精用姬姆薩染色后檢測，凍精畸形率。操作按《牛冷凍精液》（GB 4143—2008）的要求執行。

2.5.4 試驗動物

選自武威市涼州區城西肉牛養殖合作社的300 頭體重適宜、情期規律、無病適齡的母牛。

2.5.5 配種

采用同期發情技術，所有試驗母牛注射25mg 氯前列腺醇鈉，次日注射12.5mg，挑選發情變現明顯母牛200 頭，隨機分為5 組。分別用淫羊藿多糖濃度為8、4、2、0mg/mL 的凍精進行配種，0mg/mL 組作為對照，輸精3 個月時直腸孕檢。

2.6 數據處理

試驗數據使用SPSS 21 版軟件分析。

3 結果

3.1 水提醇沉法提多糖

通過水提醇沉技術，從2kg 淫羊藿原材料中提取得到 255.9134g 淫羊藿粗多糖干品。255.9134g 淫羊藿多糖干品溶解在雙蒸水中，用Savege 法脫蛋白去除淫羊藿多糖中的蛋白，然后用分液漏斗去除有機層，用醇沉法獲得109.6112g 淫羊藿多糖。

3.2 葡萄糖標準曲線

配制0.08mg/mL 葡萄糖標準品，如表1 加入試劑，在OD490 處測定吸光度。標準曲線圖以葡萄糖濃度為水平軸（X），在490nm 處的吸光度為垂直軸（Y）做回歸方程，得處相關系數為0.9997、方程為y=0.0458x+0.0035的標準曲線（見圖1）。

表1 多糖含量測定結果

圖1 葡萄糖標準曲線

3.3 蛋白標準曲線配

制0.05mg/mL 牛血清白蛋白標準品，如表2加入試劑，在OD595 處測定吸光度。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標（X），垂直軸為595nm 處吸收（Y）的回歸方程，得處相關系數為0.9971、方程為y=0.059x+0.0088 的標準曲線（見圖2）。

表2 多糖含量測定結果

圖2 蛋白質標準曲線

3.4 粗多糖糖含量測定

分別配制50μg/mL 醇沉后的淫羊藿粗多糖和Sevage 法去蛋白后的淫羊藿粗多糖溶液，取1mL配制的淫羊藿粗多糖母液，加入1mL 雙蒸水、1mL 5%苯酚、5mL 濃硫酸，待其冷卻后，在OD490 處測定吸光度。測定結果如表1，由表可以看出，醇沉后的淫羊藿粗多糖的相對質量58.86%，去蛋白后的淫羊藿粗多糖的相對質量84.12%。

3.5 粗多糖中蛋白含量測定

測定結果如表2，由表可以看出，醇沉后的淫羊藿粗多糖的相對質量7.93%，去蛋白后的淫羊藿粗多糖的相對質量14.9%。

3.6 DEAE Fast Flow 柱層析

淫羊藿多糖流色譜法快速后，用苯酚-硫酸法測定OD 值，490nm 處吸光度檢測。用蒸餾水洗脫出一個峰，合并54～76 管。得到純化的淫羊藿多糖，將收集的糖溶液凍干后，獲得純度為94.8%的淫羊藿中性多糖51.2411g。洗脫曲線如圖3。

圖3 DEAE 快流多糖洗脫曲線

3.7 淫羊藿多糖稀釋液對精子抗凍性比較

由表3 可知，2mg/mL 與其他3 組對比精子活力明顯提高，說明2mg/mL 稀釋液時最適合凍精復蘇，能最大限度保存精子生殖功能；4mg/mL、2mg/mL 與其他其他組對比，精子畸形率降低，表明此兩種淫羊藿多糖濃度可改善畸形精子。

表3 淫羊藿多糖稀釋液對精子抗凍性比較

3.8 淫羊藿多糖凍精人工授精受胎率

由表4 可知，稀釋液中淫羊藿濃度為8mg/mL 時母牛受胎率最低（50.00%），其次是4mg/mL（56.67%），與對照組相比明顯偏低。稀釋液中淫羊藿多糖濃度為2mg/mL 時人工授精受胎率最高為80.00%；2mg/mL 濃度組凍精與對照組相比，受胎率、平均每頭牛所用凍精數量為差異不大，證明牛冷凍精液稀釋液中添加2mg/mL淫羊藿多糖不會對母牛受孕造成影響。

表4 人工授精對母牛受胎率

4 結論

淫羊藿多糖在配比濃度為2mg/mL 時最適合凍精復蘇，能最大限度保存精子活力、頂體完整率，且對母牛人工授精不會產生負面影響，人工授精受胎率高達80.00%。