Carba NP 及mCIM 試驗在檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的臨床應用價值

沈旭峰，施愛軍，張雪松，王扣群

1.如東縣中醫院檢驗科，江蘇如東 226400；2.如東縣中醫院內科，江蘇如東 226400

近些年，隨著廣譜抗菌藥物的長期大量使用，細菌耐藥性增強，耐碳青霉烯類藥物腸桿菌科細菌（carbapenem resistant enterobacteriaceae, CRE）檢出率也在不斷提高。此類細菌所致感染性疾病具有一定復雜性，治療難度較大，已經成為臨床抗感染治療的棘手問題[1]。腸桿菌科細菌耐碳青霉烯類藥物的機制復雜，其中產碳青霉烯酶是主要機制，該物質能夠明顯水解碳青霉烯類抗生素的beta-內酰胺酶，從而使細菌耐藥[2]。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是檢測碳青霉烯酶耐藥基因的金標準，不過此法技術條件要求嚴苛，而且操作繁瑣，檢測成本高、效率低，同時也會受檢測基因數量、引物突變、樣本污染等原因而出現假陰性或假陽性的情況，限制了基層醫院常規實驗室開展[3]。Carba NP 試驗與改良碳青霉烯類失活法（modified carbapenem inactivation method, mCIM）試驗是近年應用于臨床的兩種碳青霉烯酶檢測方法，本文以2021 年3 月—2022 年6 月如東縣中醫院檢驗室分離出的60 株腸桿菌科細菌為例，探究兩種方法的檢測效能，以期尋找適合基層醫院開展的碳青霉烯酶檢測方法，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院臨床分離的60 株CRE，標本來源：痰液標準31 株，尿液標本12 株，胸腹水標本9 株，血液標準6 株，傷口拭子標本2 株。細菌種類：肺炎克雷伯菌39 株，大腸埃希菌11 株，產氣腸桿菌10 株。其中30 株耐碳青霉烯。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①本院收治患者住院期間臨床分離的腸桿菌科細菌，標本類型與具體菌種不限；②耐碳青霉烯腸桿菌科細菌的折點判定參照CLSI2017 年標準[4]，即美羅培南和亞胺培南至少一種最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）≥4 μg/mL。

排除標準：①重復分離的菌株；②檢測數據資料不全。

1.3 方法

1.3.1 Carba NP 試驗方法 每例菌株準備兩個EP試管，分別標記試驗管A 及對照管B。在每支EP 試管中加入100 μl 的細菌蛋白抽提液，然后用10 μl接種環從血平板上挑取受試菌株（菌株已復蘇），分別加入裝有提取液的EP 管中，進行充分振蕩混勻后，將100 μl A 液（0.05%酚紅與0.1 mmol/L ZnSO4的混合檢測液）、100 μl B 液（A 液中加入6 mg/mL 亞胺培南西司他丁鈉）分別加入上述EP 管中，完成后在37℃溫度條件下進行孵化培育2 h，期間每隔0.5 h 對其顏色變化進行觀察記錄一次。

1.3.2 mCIM 試驗方法 用10 μl 接種環從血培養基取1 滿環待測菌株將其置于含有400 μl 蒸餾水的EP 試管中，振蕩器混勻后，放入10 μg 美羅培南藥敏試紙片1 張，在37℃溫度條件下進行培育至少2 h 后，孵育臨近結束時用0.9%氯化鈉溶液制備0.5 MCF 的大腸埃希菌（ATCC 25922）菌懸液，均勻涂布于M-H 平板，取出美羅培南藥敏試紙片，將其貼在涂布大腸埃希菌質控菌株的M-H 平板上，繼續放置37℃條件下培養6 h 后進行結果觀察分析。

1.3.3 碳青霉烯酶耐藥基因PCR 檢測方法 嚴格按照有關試劑盒說明書要求操作，提取細菌DNA 后，采用PCR 擴增試驗進行碳青霉烯酶常見基因類型檢測，包括blaKPC、blaIMP、blaNDM-1、blaVIM。PCR 擴增由本院PCR 實驗室ABI-7500 儀器進行，產物測序委托上海生工生物工程公司檢測，測序結果提交BLAST 程序進行比對，確定耐藥基因的基因型。

1.4 觀察指標

統計Carba NP 試驗和mCIM 試驗對細菌碳青霉烯酶的檢出情況。以碳青霉烯酶耐藥基因PCR 檢測結果為金標準，計算Carba NP 試驗與mCIM 試驗檢測碳青霉烯酶的臨床效能（靈敏度、特異度）。

實驗過程及結果判讀嚴格按照CLSIM100-525文件推薦方法，實驗同時設置陰陽性質控對照和空白對照。Carba NP 試驗判定標準[5]：B 相對于A 顏色由紅色變化成橙或黃色后，表示結果為陽性，顏色無變化，為陰性，出現其他顏色為無效。mCIM 試驗判定標準[6]：按照實驗操作說明，對產碳青霉細菌菌株試驗結果顯示美羅培南藥敏試紙片周圍不存在抑制圈，即表示實驗結果為陽性，反之則為陰性。mCIM 試驗/Carba NP 試驗與金標準診斷均為陽性—真陽性，與金標準診斷均為陰性—真陰性，試驗陽性但金標準陰性—假陽性，試驗陰性但金標準陽性—假陰性[7]。靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%。特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。

1.5 統計方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料用例（n）和率（%）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

基于金標準，Carba NP 試驗檢測腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為90.00%（27/30）、93.33%（28/30），見表1。mCIM 試驗檢測腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為93.33%（28/30）、100.00%（30/30），見表2。兩種試驗方法的靈敏度與特異度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 Carba NP 試驗與金標準檢測結果比較(n)

表2 mCIM 試驗與金標準檢測結果比較(n)

3 討論

編碼碳青霉烯酶的基因位于可移動的遺傳原件上，可以通過質粒等傳遞給其他敏感細菌，導致耐藥基因傳播，造成CRE 流行甚至爆發。因此，檢測腸桿菌科細菌的碳青霉烯酶十分必要，可以為抗感染治療及減少耐藥菌傳播提供重要依據。

Carba NP 試驗是由Pa-trice Nordmann 領導的團隊于2012 年提出的碳青霉烯酶檢測新方法，后于2015 年被美國CLSI 抗菌藥物敏感性試驗標準操作文件（M100-S25）引入，推薦用于感染控制和流行病學研究[8]。此法采用比色法原理，適用于腸桿菌科、不動菌屬和假單胞菌屬碳青霉烯酶的表型檢測，可以對細菌細胞裂解形成的蛋白抽提液和亞胺培南進行反應，根據碳青霉烯酶對碳青霉烯類藥物的水解作用使其開環后產酸，導致pH 值降低，促使檢驗液中的酚紅出現變色反應，進而通過觀察顏色變化來判斷試驗菌株是否產碳青霉烯酶[9-10]。此法不僅可以區分沒有碳青霉烯酶活性的碳青霉烯酶易感菌，同時也可以區分產碳青霉烯酶機制與產生超廣譜β 內酰胺酶、頭孢菌素酶過表達引起細胞外膜通透性缺陷等機制介導的細菌耐藥[11]。此法操作簡單，檢測快速，可重復性好，檢測費用低，適宜在基層醫院的普通實驗室開展，而且檢測的敏感性與特異性高，可以實現碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的快速篩查[12]。本研究中，基于PCR 檢測金標準，Carba NP 試驗檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為90.00%和93.33%。有研究顯示[13]，Carba NP 試驗檢測的靈敏度與特異度分別為92.5%和92.7%，同PCR 結果一致性良好，與本文報道結論相符。不過，Carba NP 試驗結果受黏液性菌株影響，也會出現假陰性，影響檢測準確率[14]。

mCIM 試驗是在碳青霉烯類失活法（carbapenem inactivation method, CIM）實驗基礎上改良的碳青霉烯酶檢測新方法，于2017 年被CLSI 推薦用于腸桿菌科細菌產生碳青霉烯酶的表型確認試驗[15]。此法將傳統CIM 試驗中的生理鹽水改為緩釋劑三乙醇胺緩沖鹽水溶液，同時將孵育時間延長至4 h，更利于細菌生長、酶的產生以及beta-內酰胺酶水解，同時可以增強金屬酶檢測敏感性[16]。有研究指出，mCIM 試驗可以在8 h 內檢測革蘭陰性桿菌的碳青霉烯酶，對KPC、NDM、IMP、β-內酰胺酶等碳青霉烯酶的檢測靈敏度與特異度均很強，與PCR 檢測一致性高[17]。本研究中，基于金標準，mCIM 試驗檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為93.33%和100.00%，與文獻報道mCIM 試驗檢測靈敏度（95.0%）與特異度（98.0%）相符[18]，檢測效能與Carba NP 試驗基本相當。不僅如此，mCIM 試驗結果不會受細菌產生黏液的影響。有研究顯示，Carba NP 試驗中黏液性菌株可表現為弱陽性的橙色，即假陰性，而經mCIM 試驗均呈陰性，說明mCIM 試驗在篩查黏液性腸桿菌科細菌碳青霉烯酶中更具技術優勢。此外，mCIM 試驗也不受菌齡和藥敏紙片的影響，試驗使用常規藥敏紙片即可，操作簡單、成本低廉，而且結果直觀明確，適用于基層醫院微生物實驗室常規開展。不過，銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等其他耐碳青霉烯細菌日益增多，mCIM 試驗在這些細菌表型檢測中的效能與價值如何，尚需更多的試驗驗證，有待今后進一步研究。

綜上所述，Carba NP 試驗與mCIM 試驗均是檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶有效可行的方法，值得臨床應用推廣。