桔小實蠅體內三種重要生長激素及其相互影響研究

吳怡蓓

（銅仁學院 貴州銅仁 554300）

桔小實蠅（Bactrocera dorsalisHendel）屬雙翅目實蠅科果實蠅屬[1]，又名針蜂等，原產于日本九州，在我國最先發現于云貴高原，是危害性極高的國家二類檢疫性害蟲。近年來，桔小實蠅在我國西南區域大面積爆發，引發慘重的經濟虧損，成為相關領域研究的“新寵”。對桔小實蠅的防控目前仍然主要采用化學藥物防控手段，然而由于長期不規范地大范圍使用殺蟲劑，使其產生了強抗藥性，只得加大用藥量。為了緩解此類惡性循環，需要加快綠色試劑的研制。目前，對桔小實蠅的研究已經從單學科獨立研究深入到多學科交叉并輔以多種技術，防控切入點從外部環境轉移至害蟲的內環境，其中生長發育所需的重要激素成為研究首選[2]。

蛻皮激素（molting hormone, MH），在昆蟲體內受腦神經分泌到血淋巴的PTTH的調節與控制，存儲于中腸、馬氏管和脂肪體等組織中，能通過一定途徑誘導細胞程序化死亡和自噬而調節蛻皮、決定蟲體的大小和形態變化，并使組織細胞更新、產生新功能，當保幼激素濃度為零時，可加快幼蟲的內部器官的功能分化，發生變態，成蟲蛻皮，被廣泛應用于化妝品、藥物保健、病蟲害防治、養殖業等[3-5]。蛻皮激素能夠誘導幼蟲周期性蛻皮和化蛹，除了促進成蟲翅的發育和分化外，對成蟲繁殖、滯育及胚后發育等也起著調節作用，并能刺激其腦細胞的增生和卵黃蛋白的合成[6]。保幼激素（juvenile hormone, JH），具有維持幼蟲體征，保持前胸腺，影響昆蟲生殖的作用。JH作為幼蟲變態發育為成蟲的“開關”，不同變態發育類型蟲體轉變時激素濃度不同，在腦激素的主導下，再聯合蛻皮激素一同發揮作用，共同調控昆蟲生殖代謝、催化反應，甚至聯合昆蟲的類胰島素及其通路對壽命進行調控[7]。胰島素（insulin, INS）對機體的正常 生長繁殖、新陳代謝、動作行為等過程具有不可替代的調節作用[8]，其信號位點處于保幼激素前，需要與其他激素聯合發生連鎖反應以達到調節目的[9]。相關研究表明，胰島素與蛻皮激素和保幼激素及其相關受體間存在相互作用關系，彼此間相互影響，聯合調節昆蟲的生長發育[10]。放眼未來，昆蟲的內源激素能在病蟲害防控的實際操作中展現出巨大的優勢和開發潛能。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究所用桔小實蠅均使用合作單位西南大學昆蟲生態分子實驗室人工飼養種群。

1.2 處理方法

通過鮮榨的橙汁引導適齡雌蟲產卵，收集卵置于流水下清洗干凈，隨機選取足量完整的卵在保鮮膜上孵化0.25 d。將孵化時間內孵出的幼蟲轉移至人工飼養環境。在臺式顯微鏡下，手持桔小實蠅5日齡幼蟲，將配制好的三種激素（INS、JH以及MH）母液500 ng分別于倒數第3腹節背面節間處注射進入幼蟲體內，以加入染料的緩沖液（ddH2O）作為對照。注射完后將幼蟲重新放入含幼蟲飼料的培養皿中，放置于人工氣候箱中飼養，溫度為（27±0.5）℃，相對濕度為（70±5）%，無光照。激素注射后第1 h、4 h、8 h、12 h觀察，并隨機挑取6頭幼蟲，快速投入液氮中，保存于-80 ℃，每組樣品3次重復。

1.3 數據處理

數據整理使用Microsoft office Excel軟件完成，數據由MxPro 4.01導出，采用2-ΔΔCT方法進行分析[11]。數據利用SPSS軟件進行單因素方差分析（ANOVA，LSD）或獨立樣本t測驗，對激素表達水平進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 桔小實蠅幼蟲體內三種重要生長激素滴度測定

2.1.1 桔小實蠅幼蟲體內INS滴度

將100 μg/mL的INS母液分別稀釋1.25倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍后，通過高效液相色譜儀對六組標準液進行進樣分析得出多峰色譜圖，不同實驗濃度的第一個小峰到最后一個小峰均出現在17 min～18 min間，主峰靠近18 min，說明INS溶液的出峰時間與主峰出現時間重合，均在18 min左右。使用Microsoft office Excel繪制標準曲線如圖1（a）所示，推算出峰面積與濃度的關系為y=7.9623x+9.1758，其R2值為0.9982。

收集不同蟲齡桔小實蠅幼蟲，利用HPLC技術測定幼蟲體內INS的滴度，結果顯示，INS在桔小實蠅的整個幼蟲時期均有表達，且滴度變化相對平穩，只有在L5階段有顯著的升高，平均滴度為18.489 38 ng/g，其余時期其滴度均無顯著性差異。

2.1.2 桔小實蠅幼蟲體內JH滴度

將100 μg/mL的JH-Ⅲ母液分別稀釋1.25倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍后，通過高效液相色譜儀對六組標準液進行進樣分析得出多峰色譜圖，不同實驗濃度的第一個小峰到最后一個小峰均出現在11 min～13 min間，主峰靠近11 min，說明JH-Ⅲ溶液的出峰時間與主峰出現時間重合，均在11 min左右。使用Microsoft office Excel繪制標準曲線如圖1（b）所示，推算出峰面積與濃度的關系為y=8.1949x+9.6512，其R2值為0.9984。

收集不同蟲齡桔小實蠅幼蟲，利用HPLC技術測定幼蟲體內JH的滴度，結果顯示，JH在桔小實蠅的整個幼蟲時期均有表達，且滴度變化相對較大。其中，在L3階段JH滴度水平達到最高值27.953 94 ng/g，顯著高于其他時期，隨后逐漸降低。

2.1.3 桔小實蠅幼蟲體內MH滴度

將100 μg/mL的MH母液分別稀釋1.25倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍后，通過高效液相色譜儀對六組標準液進行進樣分析得出多峰色譜圖，不同實驗濃度的第一個小峰到最后一個小峰均出現在20 min～21 min間，主峰靠近21 min，說明MH溶液的出峰時間與主峰出現時間重合，均在21 min左右。使用Microsoft office Excel繪制標準曲線如圖1（c）所示，推算出峰面積與濃度的關系為y=9.9623x+9.5872，其R2值為0.9937。

圖1 三種激素滴度標準曲線

收集不同蟲齡桔小實蠅幼蟲，利用HPLC技術測定幼蟲體內MH的滴度，結果顯示，MH在桔小實蠅的整個幼蟲時期均有表達，滴度變化相對平穩，只有在L3與L5階段有顯著性差異，其余時期其滴度均無顯著性差異。

2.1.4 桔小實蠅幼蟲體內三種重要生長激素滴度水平相互關系

分析上述實驗數據，繪制出桔小實蠅體內三種重要生長激素滴度水平的相互關系圖如圖2。數據結果表明，INS、JH、MH三種激素在桔小實蠅的整個幼蟲時期均有表達，其中INS與MH的滴度變化相對平穩，只有在L3與L5階段有顯著性差異，其余時期其滴度均無顯著性差異；JH的滴度變化相對較大，在L3階段滴度水平顯著高于其他時期，其后逐漸降低。在桔小實蠅L1階段，JH的滴度水平為18.980 59 ng/g，顯著高于MH的13.767 76 ng/g，兩者與同時期桔小實蠅體內INS滴度水平沒有顯著性差異。L3階段，桔小實蠅體內INS與MH滴度水平均為12.733 18 ng/g，而同時期JH滴度水平為27.953 94 ng/g，顯著高于INS和MH滴度水平。L5及L7時期，三種激素均保持較高量表達，滴度水平之間不存在顯著性差異。

圖2 不同蟲齡桔小實蠅幼蟲三種生長激素滴度

由此可以推出，INS、JH、MH三種激素在桔小實蠅從卵孵化后到化蛹前的生長發育階段均發揮重要作用，且相互間存在動態關系。

2.2 桔小實蠅幼蟲體內三種重要生長激素之間的相互影響

根據上述結果，選擇利用三種生長激素表達量相對較高的L5時期的桔小實蠅幼蟲開展三種生長激素間的相互影響研究。

對桔小實蠅5日齡幼蟲注射500 ng INS母液，利用HPLC技術檢測12 h后幼蟲體內JH、MH兩種激素的滴度水平。結果如圖3（a）所示，注射INS母液后，JH、MH兩種激素的滴度水平均顯著升高，說明胰島素能促進蛻皮激素和保幼激素的分泌，調控桔小實蠅生長發育。

對桔小實蠅5日齡幼蟲注射500 ng JH母液，利用HPLC技術檢測12 h后幼蟲體內INS、MH兩種激素的滴度水平。結果如圖3（b）所示，注射JH母液后，INS滴度水平顯著升高，而MH滴度水平顯著下降，說明保幼激素能促進胰島素的分泌同時抑制蛻皮激素的分泌，從而影響桔小實蠅的生長發育。

對桔小實蠅5日齡幼蟲注射500 ng MH母液，利用HPLC技術檢測12 h后幼蟲體內INS、JH兩種激素的滴度水平。結果如圖3（c）所示，注射MH母液后，INS滴度水平下降但不顯著，而JH滴度水平顯著下降，說明蛻皮激素能抑制保幼激素的分泌，從而影響桔小實蠅的生長發育。

圖3 一種激素處理后其他激素滴度水平變化

3 討論

變態類昆蟲成蟲體型大小決定于化蛹前的營養和激素水平，并且在幼蟲期和若蟲期其生長速度很快。根據數據推斷出桔小實蠅蟲卵孵化為幼蟲后的前3 d里，幼蟲處于最虛弱狀態，會出現一次蛻皮高峰期，迫切需要生理生化過程為其生長發育提供“建材”以提升自己的生存機會。此時JH占據主導地位，聯合INS促進幼蟲的生殖代謝，促進卵巢成熟，同時將脂肪體中的卵黃轉化為蛋白，成為營養素的固著載體，提高免疫力的同時進一步加強生理調節，是幼蟲變態發育為成蟲質變所需的物質積累。此時，較低濃度的MH促進了組織細胞的生長和增殖，INS的液相色譜圖上出現小峰時，意味著表皮細胞開始啟動基因編碼程序使之從幼蟲向蛹轉化。

依據上述結果可以發現，桔小實蠅幼蟲第1 d～3 d是其幼蟲生長過程中營養累積的關鍵時期。因此，在該階段需要大量JH的作用來維持幼蟲身體形態的穩定性，所以JH含量顯著高于其他生長激素。蟲卵孵化后的5 d～8 d，三種激素滴度水平基本持平，有了一定的JH基礎后，昆蟲的體積增大，對能量的需求也同步開始增大，導致其對INS和MH的需求增大，隨著新陳代謝的加快，更新自身的細胞、組織，從而維持自身的生命活力。

在昆蟲生長發育過程中，由于不同發育階段需要完成的生長任務不同，體內激素水平也會不一致。桔小實蠅幼蟲體內胰島素、蛻皮激素、保幼激素在其生長發育過程中均扮演者重要角色，三者之間能夠相互促進、相互抑制，通過互相影響來維持桔小實蠅幼蟲期生長發育的穩定性，滿足其生長發育過程中的不同需求，從而保證其正常生長。昆蟲的激素會借助體液、淋巴等調控其生活[2]，激素作用的研究因而不可規避。本研究采用HPLC技術對不同蟲齡的桔小實蠅幼蟲體內的INS、JH、MH的滴度進行測定，結果顯示，三種激素在整個幼蟲期均發揮了作用，彼此間相互影響。INS和MH呈漸進式變化，而JH在L3階段發生跳躍式變化，含量顯著升高，與錢明惠等（2006）對雙斑恩蚜小蜂體內激素變化探究結果[8]的趨勢一致，說明能量轉換、組織細胞的更新換代、蟲體的營養積累需要INS、MH的持續作用；在L3階段幼蟲的形態發育和翅型的分化進程大大加快，與張瓊秀等（2008）使用三種外源激素類似物對不同階段白背飛虱翅型處理的最佳階段[12]結果相同。由MH與JH的含量變化可知，低濃度的MH可以促進JH的合成，高濃度的MH會抑制JH的合成，JH與MH一同維護前胸腺正常運行并承受神經內部的分泌系統釋放的應激壓力[13]，咽側體受蛻皮激素刺激后會分泌出保幼激素在煙草天蛾中已經被證實。

4 展望

本研究最終得出INS、JH和MH在桔小實蠅生長發育中扮演著重要角色，發揮著不同作用。此前的研究也證實，蛻皮激素和保幼激素能通過各自的信號通路作用于靶細胞推動相應蛋白的合成，其研究成果已被廣泛應用于經濟昆蟲的增產增收上，而對于其調控卻還是存在著難以攻克的技術壁壘[14]。探索昆蟲激素不僅為昆蟲和激素的理論體系添磚加瓦，而且在農業害蟲防治的實際應用方面顯示出巨大的優越性和潛力，能夠促進新型生物農藥與制劑的進一步研發，并為持續防控害蟲提供新的思路和方法。

5 結語

本實驗發現INS與MH以及JH與MH間均存在協同作用，但目前對桔小實蠅的重要內源激素，如胰島素、保幼激素類似物、蛻皮激素等的系統研究尚少，內在機制如JH和MH參與其形態發育時調控昆蟲翅型分化等的機制還未被揭露，有待深入研究以切斷蟲害發生地的延伸。