氣相色譜-三重四極桿質譜法測定綠茶中35種農藥殘留

高堯華，劉夢琳，李林杰，孫 立，張曉文，閻 炳，張鴻偉*

（1.日照海關，山東 日照 276826；2.青島海關技術中心，山東 青島 266114）

綠茶因含有多種氨基酸和豐富的礦物質等營養(yǎng)成分，多年來占據(jù)我國傳統(tǒng)飲品的重要位置，同時也是我國主要出口經(jīng)濟作物之一，廣受國內外市場好評。近年來茶葉的需求量增大，種植面積及生產(chǎn)規(guī)模相應擴大，但部分茶農的食品安全意識淡薄，在茶樹種植采摘期間用藥種類及劑量不科學，導致部分茶葉中農藥殘留污染問題，不但影響廣大消費者對茶類產(chǎn)品的認可度，更引起對茶類食品安全的關注。我國最新國家標準（GB 2763-2021 和GB 2763.1-2022）規(guī)定了茶葉中71 種農藥的最大殘留限量［1-2］，歐盟規(guī)定了茶葉中502種農藥、日本相關法規(guī)規(guī)定了230種農藥的最大殘留限量［3］，且規(guī)定茶葉中多種農藥的最大殘留限量最小值為0.01 mg/kg［4］。因此，茶葉中農藥殘留檢測方法的性能指標事關農藥殘留控制，影響我國茶葉產(chǎn)業(yè)對外貿易發(fā)展。

目前，茶葉類產(chǎn)品中農藥殘留的分析方法主要以色譜和質譜測定為主［5-10］。茶葉基質復雜，增加了農藥殘留分析難度，因此降低茶葉基質影響，提高檢測方法的準確度和靈敏度成為茶葉分析的關鍵技術。QuEChERS 法因具有通用性強、操作簡單快速等優(yōu)點，在農藥殘留前處理中已被廣泛應用。茶葉作為復雜基質植物源性產(chǎn)品，在前處理過程中主要使用QuEChERS 法［11-13］和固相萃取法［14-16］。本研究根據(jù)GB 2763-2021 及GB 2763.1-2022 的檢測要求，通過優(yōu)化QuEChERS 前處理方法，建立了同時測定綠茶中35種常用農藥的氣相色譜-三重四極桿質譜法。該方法檢測靈敏度高，可實現(xiàn)茶葉中35種常用農藥的準確測定，可為茶葉類產(chǎn)品的質量安全把控提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A-7000B 氣相色譜-三重四極桿質譜儀（美國Agilent 公司）；IKA KS260 振蕩器（德國IKA 公司）；Buchi 旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；IKA MS3 basic 渦旋混勻器（德國IKA公司）。

乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；丙酮、正己烷（色譜純，德國Merck 公司）；氯化鈉（分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司）；十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）購于天津博納艾杰爾股份有限公司。

1.2 標準溶液配制

35種農藥標準品（農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，純度均大于99%，質量濃度均為1 000 μg/mL）：具體名稱見表1，用丙酮-正己烷（3∶7，體積比）混合溶液稀釋，配制成質量濃度為10 μg/mL的混合中間標準溶液，于-18 ℃冰箱避光、密封保存，保存期為6個月。

表1 35種化合物的儀器分析參數(shù)Table 1 Parameters for instrumental analysis of 35 compounds

標準工作溶液的配制：準確移取適量混合中間標準溶液，用經(jīng)確證不含目標農藥的綠茶空白基質提取液稀釋成10、20、50、100、200、500、1 000 μg/L的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

準確稱取2.00 g（精確至0.01 g）茶葉試樣，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 85 ℃熱水充分浸泡30 min，放涼后，加入20 mL 乙腈振蕩提取30 min，加入5 g 氯化鈉渦旋1 min，以5 000 r/min 離心5 min。移取10 mL 上清液至盛有200 mg PSA、200 mg C18、50 mg GCB 的凈化管中，渦旋30 s，過濾至雞心瓶中，濾液經(jīng)45 ℃旋轉蒸發(fā)至近干，加入1.0 mL 丙酮-正己烷（3∶7）混合溶液定容后，過0.22 μm濾膜，供上機分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；載氣：高純氦氣（99.999%）；碰撞氣：高純氮氣（99.999%）；流速：1.1 mL/min；進樣方式：不分流進樣；升溫程序：50 ℃保持2 min，以25 ℃/min 程序升溫至150 ℃保持6 min，再以3 ℃/min 程序升溫至200 ℃，最后以8 ℃/min程序升溫至280 ℃保持7 min；進樣口溫度：260 ℃；進樣量：1.0 μL；溶劑延遲：5 min。

1.4.2 質譜條件離子源：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；輔助加熱溫度：280 ℃；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式。35種化合物的儀器分析參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化綠茶的沖泡建議溫度為85 ℃，為準確測得人體攝入茶湯中農藥殘留含量，本實驗采用85 ℃熱水沖泡。在100 μg/L 的35 種農藥標準溶液中，加入85 ℃熱水沖泡后，采用乙腈提取并濃縮定量，測得定量后溶液與等濃度未加入熱水的標準溶液的濃度差小于10%。綜合回收率實驗結果，說明35種農藥在加入85 ℃熱水后無降解。

根據(jù)茶葉中常用農藥的化學性質，在其他條件相同的情況下，考察了甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙腈、0.2%及0.5%（體積分數(shù)）甲酸-乙腈作為提取溶劑的提取效果。結果顯示，丙酮可提取多種色素，提取液呈深綠色近似黑色；甲醇提取液呈墨綠色；乙腈提取液呈綠色；對于甲酸-乙腈提取液，甲酸的加入對色素類化合物無影響，其提取液顏色較乙腈提取液無明顯變化；正己烷提取液中色素類化合物較少，呈淺綠色；乙酸乙酯提取液顏色介于乙腈和正己烷提取液顏色之間。各提取液顏色排序：丙酮＞甲醇＞乙腈及甲酸-乙腈＞乙酸乙酯＞正己烷。此外，通過添加100 μg/kg的35種農藥對上述提取溶劑的回收率進行考察（見表2）。結果表明，乙腈及甲酸-乙腈的回收率明顯優(yōu)于其他提取溶劑，與乙腈相比，甲酸-乙腈在提取過程中對目標物回收率的改善不明顯，僅有5 種目標物采用甲酸-乙腈提取的回收率略高，其他30種目標物與采用乙腈提取的回收率相當或略低。因此實驗選擇乙腈為提取溶劑。

表2 提取溶劑對35種農藥回收率的影響Table 2 Effect of extraction solvents on the recoveries of 35 pesticides

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化茶葉中含有多種色素及堿性組分等復雜基質，樣品經(jīng)乙腈提取后提取液中含大量色素及部分脂類共提取物。實驗選取QuEChERS 方法的常用凈化劑（PSA、C18、GCB）對樣品進行凈化處理。

根據(jù)3 種吸附劑的性質［17］，選取同一茶葉空白樣品，按照相同實驗過程，選取不同配比的PSA、C18和GCB 為凈化材料，以未添加凈化劑的空白組為對照，考察對同一樣品中添加相同濃度（50 μg/kg）35種農藥的回收率差異。實驗發(fā)現(xiàn)，綠茶基質中吸附劑種類和用量均可影響35種農藥的回收率。GCB可有效去除綠茶中色素類化合物；C18能夠吸附綠茶樣液中脂類化合物；提取液經(jīng)濃縮后，未添加C18的樣品均含可流動油狀物，未加入3 種凈化劑的樣液濃縮后呈深綠色粘稠狀，復溶后樣液出現(xiàn)分層，導致目標物的回收率較低，且污染離子源和色譜柱。經(jīng)綜合考察，選擇PSA+C18+GCB 作為凈化劑，提高了目標分析物的回收率，減少了綠茶中脂類和色素類共提取物。為更直觀體現(xiàn)凈化后回收率的改善效果，以35種化合物經(jīng)不同凈化劑凈化后的回收率與其所測最高回收率的比值為縱坐標作圖，對比結果見圖1。鑒于六六六、滴滴涕同分異構體之間凈化效果的差異小于5%，其凈化效果在圖1中合并表示。

圖1 不同凈化劑對35種化合物含量的影響Fig.1 Effect of different purifying agents on the contents of 35 compounds

選取PSA、C18用量為50～400 mg，GCB 用量為25～200 mg，對凈化劑用量組合進行了優(yōu)化。結果顯示，增加凈化劑的用量可提高目標物的凈化效果，但當PSA、C18的用量＞300 mg，GCB用量＞50 mg時甲胺磷、乙酰甲胺磷、硫丹、百菌清、氰戊菊酯、苯醚甲環(huán)唑、溴氰菊酯等化合物的回收率降低。綜合考慮，確定凈化材料用量為200 mg PSA、200 mg C18、50 mg GCB。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

根據(jù)歐盟96/23/EC 要求，質譜方法定性至少達到4個識別點的要求［18］。三重四極桿質譜在MRM 模式下，1 個母離子加上2 個及以上子離子的識別點≥4。將質量濃度為10 μg/mL 的35 種農藥標準溶液進行質譜全掃描模式采集，確定每種化合物的保留時間，并選擇豐度高、m/z大的特征離子，在MRM 模式下優(yōu)化碰撞能量，選擇1對豐度較高且基質影響較小的離子對作為定量離子對，另1對作為定性離子對，優(yōu)化后的參數(shù)見表1。35種農藥標準溶液的總離子流圖見圖2。

圖2 35種化合物在MRM模式下的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of 35 compounds in MRM mode the number denoted was the same as those in Table 1

2.3 基質效應

根據(jù)文獻［19-22］，基質效應（ME）計算方法為：ME=（基質中目標分析物的定量離子峰面積/溶劑中目標分析物的定量離子峰面積-1）×100%。當｜ME｜≤20%，通常認為基質效應較小，可不考慮基質效應影響；20%＜｜ME｜≤50%，表明存在中等基質效應；當｜ME｜＞50%，表明存在較強基質效應，會導致目標化合物定量不準確［23-26］。

對比了200 μg/L 基質匹配標準溶液和溶劑標準溶液的峰面積，平行測定6 次。結果表明，35 種化合物中，大于70%的化合物表現(xiàn)為強基質效應。綜合考慮，本實驗選用基質匹配標準工作曲線進行定量，以降低基質效應的影響。

2.4 線性關系與檢出限

配制10、20、50、100、200、500、1 000 μg/L 系列質量濃度的基質匹配標準溶液，在優(yōu)化的色譜及質譜條件下進行測定，以35種農藥的質量濃度（μg/L）為橫坐標，以定量離子所對應的峰面積為縱坐標，得到各目標物的線性方程。結果顯示，35種化合物在10～1 000 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(shù)（r2）大于0.99。分別以3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比所對應的質量濃度確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到35種化合物的LOD為1～5 μg/kg，LOQ為5～15 μg/kg（見表3）。

表3 35種化合物的檢出限、定量下限、平均回收率與相對標準偏差（n=6）Table 3 LODs，LOQs，average recoveries and relative standard deviations（n = 6） of 35 compounds

（續(xù)表3）

2.5 回收率及相對標準偏差

選取經(jīng)檢測無目標農藥殘留的市售綠茶為空白基質，分別添加低、中、高3 個不同水平（20、40、200 μg/kg）的35種農藥標準溶液，進行空白加標實驗，每個加標濃度平行測定6次，結果見表3。結果顯示，加標樣品中35 種農藥的平均回收率為70.3%～112%，相對標準偏差（RSD）為1.6%～12%，該方法的精密度和準確度均符合農藥殘留檢測要求。

2.6 實際樣品測定

根據(jù)日照產(chǎn)茶區(qū)分布特點，選取奎山、巨峰、三莊3 個主產(chǎn)地作為研究對象，對同一種植區(qū)春、夏、秋3 季茶葉中的農藥殘留概況進行分析。采用本方法對上述產(chǎn)區(qū)市售30 份日照綠茶樣品（春茶12份，夏茶9份，秋茶9份）進行檢測。由表4可見，12份春茶中巨峰、奎山兩地各有1份樣品檢出，9份夏茶中僅巨峰有1份樣品檢出，9份秋茶中僅巨峰有1份樣品檢出。

表4 日照綠茶樣品中農藥殘留檢出概況（μg/kg）Table 4 Overview of pesticide residues in Rizhao green tea samples（μg/kg）

實驗結果表明，日照綠茶中春茶和秋茶的農藥殘留種類主要為毒死蜱、溴蟲腈、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯；夏茶的農藥殘留種類主要為毒死蜱、溴蟲腈、聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯，以上檢出農藥的殘留量均未超過國家要求的最大殘留限量。

采用本方法對5份日照紅茶、1份金駿眉、1份南京綠茶、2份西湖龍井和1份鐵觀音進行加標回收實驗（100 μg/kg），35 種農藥的回收率為77.0%～115%，回收率符合要求，表明本方法不受上述樣品種類限制。

2.7 本法與國家標準方法的比較

目前我國已發(fā)布的茶葉中農藥殘留檢測國家標準方法主要有GB 23200.13-2016［27］、GB 23200.113-2018［28］和GB/T 23204-2008［29］。GB 23200.13-2016和GB/T 23204-2008在前處理過程中均采用固相萃取柱凈化，且樣品用量大；本方法采用QuEChERS前處理方法，操作簡單快速，樣品用量少、試劑消耗少，污染小。GB 23200.113-2018 雖采用QuEChERS 前處理方法，但本實驗針對35 種綠茶種植常用農藥的化學性質，對QuEChERS 方法中3 種凈化劑的配比進行優(yōu)化，提高了方法的靈敏度和準確性。同時，前處理采用85 ℃熱水沖泡，能更準確反映實際攝入的農藥殘留量。綜上，本方法操作簡單、快速、準確，可作為標準方法的有效補充。

3 結 論

本文建立了綠茶中35種常用農藥的QuEChERS/氣相色譜-三重四極桿質譜測定方法，樣品用85 ℃熱水沖泡放涼后，采用乙腈提取，經(jīng)優(yōu)化的QuEChERS 前處理方法凈化后，采用MRM 模式進行檢測。該方法操作簡單，檢測效率高，成本較低，適用于綠茶中農藥殘留的準確定性和定量分析，為綠茶中農藥殘留監(jiān)測提供了技術支持。