牛磺酸通過調控AKT/NF-κB通路改善膿毒癥小鼠肝臟損傷的保護作用

胡玉蓮 安佰麗 劉超 高慧婕

1日照市人民醫院，日照 276826；2濟寧醫學院藥學院，日照 276826

炎癥是機體的一種防御反應，主要表現為紅、腫、熱、痛、功能障礙等，一旦得不到有效控制，將會導致嚴重的病理反應，例如膿毒癥、自身免疫病等［1］。膿毒癥可引起嚴重的炎癥性組織損傷，主要是由于白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β等促炎性因子過量產生所致［2-3］。在過去十幾年中，由膿毒癥導致的病死率居高不下，消耗了巨大的醫療資源［4］。肝臟是調控免疫和炎性反應的主要器官，膿毒癥早期即可由于肝細胞缺血、缺氧導致肝損傷，發生嚴重炎性反應和過度氧化應激［5］。肝功能損傷會嚴重影響膿毒癥的預后，可作為引發多器官功能衰竭和死亡的重要預測因子［6］。因此，尋找有效靶點，防治膿毒癥所致肝損傷具有重要臨床意義。

牛磺酸（taurine）化學名稱是2-氨基乙磺酸，化學結構式為H2NCH2CH2SO3H。牛磺酸既是一種具有廣泛生理、藥理作用的中藥有效成分，是名貴中藥“牛黃”的有效成分之一，又是動物體內必需營養元素，參與動物機體的細胞體積調節、滲透壓調節等重要生理過程，并具有抗氧化和抗炎活性，對動物機體的穩態具有重要意義［7-9］。因此，牛磺酸抗炎、抗氧化以及緩解疾病的功效成為近些年的研究熱點。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌壁的主要成分，可刺激宿主在膿毒性過程中釋放多種炎癥介質，可用來建立膿毒癥經典模型［10］。本次研究采用LPS構建膿毒癥小鼠模型，探討牛磺酸對由LPS所致膿毒癥肝損傷小鼠的抗炎、抗氧化活性及其分子機制，為牛磺酸治療膿毒癥肝損傷應用于臨床提供有效實驗依據。

材料與方法

1.實驗試劑

牛磺酸購自上海葉源生物科技有限公司（S20155-25g），4%的多聚甲醛購自Biodharp Life Science（BL539A），Mouse IL-10 ELISA（酶聯免疫吸附試驗）Kit、Mouse IL-1β ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA Kit購自武漢基因美生物科技有限公司，RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒、SDS-PAGE電泳液（Tris-Gly，Powder）均購自Beyotime Biotechnology，HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R323-01）、SYBR Green Master Mix（Q111-02）購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Tubulin抗體（AT819）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（H+L）（A0216）購自Beyotime Biotechnology，核因子（NF）-κB抗體（66535-1）、蛋白激酶B（AKT）抗體（60203-2）均購自Proteintech，核因子κB抑制蛋白（IκB）-α抗體（AI096）購自Beyotime Biotechnology。

2.實驗動物

50只ICR雄性小鼠，4～5周齡，體質量18～22 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）2022 0006。小鼠自由攝食飲水，室溫（23.00±1.00）℃，晝夜循環12 h。本次實驗動物符合倫理學標準，經過濟寧醫學院實驗動物倫理委員會批準。

3.實驗方法

3.1.實驗動物分組及處理 本研究于2022年2月至7月進行。小鼠適應性喂養1周，隨機分為5組：空白對照組（Control組）、LPS造模組（LPS組）、牛磺酸低劑量組（L+L組）、牛磺酸中劑量組（L+M組）、牛磺酸高劑量組（L+H組）。牛磺酸腹腔注射給藥，L+L組（100 mg/kg）0.2 ml/d，L+M組（200 mg/kg）0.2 ml/d，L+H組（400 mg/kg）0.2 ml/d，Control組與LPS組每天注射等體積生理鹽水。實驗第7天，Control組注射生理鹽水，LPS組與牛磺酸用藥組均注射LPS（10 mg/kg）。6 h后眼球取血，室溫靜置30 min后，以3 500 r/min離心15 min（離心半徑85 mm），取上清液-80 ℃保存；摘取肝臟、腎臟和肺臟。

3.2.臟器指數計算 精密天平稱量肝臟、腎臟和肺臟，計算臟器指數：肝臟（腎臟、肺臟）指數=肝臟（腎臟、肺臟）質量/小鼠體質量×100%。

3.3.小鼠肝臟組織蘇木精-伊紅（HE）染色 小鼠肝臟用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，并切成4 μm矢狀切片。脫蠟處理（20 min/次，共3次）。將切片依次置于100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中梯度脫水。HE染色。乙醇中梯度脫水后置于新鮮二甲苯溶液中浸泡（5 min/次，共2次）。中性樹脂封片，鏡下觀察。

3.4.小鼠全血血常規指標檢測 取小鼠全血，按照動物血液細胞分析儀的要求上機檢測。

3.5.測定小鼠肝組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力 使用生理鹽水沖洗0.5 g肝臟組織，制備10%組織勻漿。根據說明書進行取樣操作。采用多功能酶標儀分別在412 nm、550 nm和532 nm處檢測SOD和MDA的吸光度值，并根據公式計算活性和含量。

3.6.小鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-10含量的測定 按照ELISA試劑盒使用說明書操作，使用酶標儀在給定的波長下測定加樣后的酶標板各孔的吸光度。按照給定公式計算IL-1β、IL-6和IL-10的濃度。

3.7.Western blot測定小鼠肝臟NF-κB、IκB和AKT的表達 使用RIPA裂解液裂解組織，使用前加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑混勻。BCA檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉膜。封閉液震蕩封閉2 h。封閉完成后去除封閉液加入一抗（NF-κB 1∶1 000、AKT 1∶2 000和IκB 1∶1 000），室溫下搖洗孵育2 h后過夜。次日Western洗滌液洗滌3次，每次搖洗10 min。加入二抗（山羊抗小鼠IgG 1∶2 000）孵育后洗滌。ECL顯色，將PVDF膜放入多功能成像儀中檢測。

3.8.免疫組化檢測小鼠肝臟組織中NF-κB的表達 切片脫蠟后浸入二甲苯中3次，每次10 min，而后浸入到無水乙醇中3次，每次5 min；滴加3%過氧化氫（H2O2），室溫處理8 min，蒸餾水清洗3次。熱抗原修復后，滴加封閉液，室溫封閉20 min，滴加NF-κB一抗4 ℃過夜。PBS清洗3次，滴加稀釋好的二抗，常溫孵育30 min。PBS清洗，后滴加鏈霉親和素工作液，室溫孵育30 min。DAB顯色。蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。

4.統計學分析

計量資料均符合正態分布，采用均數±標準差來表示，采用t檢驗或單因素方差分析進行組間比較。所有數據使用Prism 9.3.1統計軟件進行分析，P＜0.05差異有統計學意義。

結果

1.牛磺酸對LPS膿毒癥小鼠臟器指數的影響（圖1）

圖1 牛磺酸對膿毒癥小鼠臟器指數的影響

與Control組相比，LPS組小鼠肝臟指數、腎臟指數以及肺臟指數均顯著升高（均P＜0.001），LPS膿毒癥模型制備成功。與LPS組相比，牛磺酸用藥組（L+L組和L+H組）的肝臟指數降低（P＜0.05，P＜0.001），L+M組肝臟指數呈下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與LPS組相比，L+M組和L+H組的腎臟和肺臟指數降低（P＜0.05，P＜0.01），L+L組腎臟和肝臟指數呈下降趨勢，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）。從臟器指數水平顯示出牛磺酸對肝臟、腎臟和肺臟均具有一定的抗炎保護作用。

2.牛磺酸對小鼠肝臟組織形態的影響（圖2）

圖2 牛磺酸對膿毒癥小鼠肝臟組織形態的影響（A.Control組；B.LPS組；C.L+L組；D.L+M組；E.L+H組）（HE染色 ×100）

HE染色結果顯示，LPS組小鼠肝組織產生明顯損傷，肝臟結構混亂，肝索紊亂，肝細胞排列混亂，大小不一，出現炎性細胞浸潤，牛磺酸用藥組（L+L組、L+M組和L+H組）小鼠肝臟組織均呈現一定程度的恢復，肝組織排列較為清晰。

3.牛磺酸對LPS膿毒癥小鼠血常規指標影響（圖3）

圖3 牛磺酸對膿毒癥小鼠血常規的影響

與Control組相比，LPS組白細胞計數和粒細胞比率均顯著升高（均P＜0.001），淋巴細胞比率顯著降低（P＜0.001）。與LPS組相比，牛磺酸用藥組（L+L組、L+M組和L+H組）的白細胞計數和粒細胞比率顯著降低（P＜0.05，P＜0.001），淋巴細胞比率均顯著升高（均P＜0.001），顯示牛磺酸可有效改善LPS造成的淋巴細胞比率與粒細胞比率的異常，且呈現明顯的濃度依賴性，高濃度牛磺酸用藥L+H組效果最佳。

4.牛磺酸對LPS膿毒癥小鼠SOD和MDA的影響（圖4）

圖4 牛磺酸對膿毒癥小鼠SOD（A）和MDA（B）的影響

與Control組相比，LPS組SOD活力顯著下降（P＜0.05）；與LPS組比，L+M組SOD活力升高（P＜0.01），L+L組、L+H組SOD活力有升高趨勢，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）。與Control組相比，LPS組MDA含量顯著增高（P＜0.01）；與LPS組相比較，L+L組、L+M組MDA含量降低（均P＜0.05），L+H組MDA含量有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

5.牛磺酸對LPS膿毒癥小鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-10的表達影響（圖5）

圖5 牛磺酸對膿毒癥小鼠IL-1β（A）、IL-6（B）和IL-10（C）的影響

與Control組相比，LPS組IL-1β、IL-6含量顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），IL-10含量下降（P＜0.05）。與LPS組比，L+M組和L+H組的IL-1β含量降低（均P＜0.01），L+L組IL-1β含量有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；牛磺酸用藥組（L+L組、L+M組和L+H組）IL-6含量降低（均P＜0.05）；L+H組IL-10含量升高（P＜0.05），L+L組、L+M組IL-10含量有上升趨勢，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

6.牛磺酸對LPS膿毒癥小鼠肝臟組織中NF-κB、IκB和AKT表達的影響

與Control組相比較，LPS組的NF-κB、AKT表達增多，IκB的表達減少。與LPS組相比，L+H組NF-κB、AKT表達降低，IκB的表達升高，見圖6。與Control組相比，LPS組小鼠肝臟組織棕褐色明顯增多，NF-κB表達升高；L+H組小鼠肝臟棕褐色顆粒表達下降，NF-κB原位表達降低，見圖7。

圖6 牛磺酸對膿毒癥小鼠肝臟NF-κB、IκB和AKT表達的影響

圖7 牛磺酸對膿毒癥小鼠肝臟的NF-κB表達的影響（A.Control組；B.LPS組；C.L+H組）（免疫組化法 ×100）

討論

牛磺酸藥用價值廣泛，具有鎮靜催眠、鎮咳祛痰平喘、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射等多項藥理活性［7-9］，中國藥典二部將其歸為鎮靜消炎類藥物。牛磺酸主要通過抗氧化和抗炎活性發揮對細胞的保護作用，對機體穩態的維持具有重要意義［11-12］。針對炎癥性損傷，牛磺酸能夠促進中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬活力，提升機體天然免疫應答［14］。牛磺酸被認為是一種極具前途的抗炎藥物，但目前有關牛磺酸發揮抗炎活性防治膿毒癥致肝損傷的作用機制尚未明確。

本實驗采用10 mg/kg LPS制備膿毒癥模型，結果顯示模型組小鼠肝臟、腎臟和肺臟指數均顯著升高，同時血清中炎癥性細胞因子IL-1β、IL-6的表達顯著增加，膿毒癥致肝損傷模型制備成功。而牛磺酸干預能夠有效降低小鼠肝臟、腎臟和肺臟指數，減少IL-1β、IL-6的產生，降低機體炎性反應，對膿毒癥產生了良好緩解作用。氧化應激與炎癥息息相關，有研究證明，外源性抗氧化劑可以對炎癥起到一定治療作用［15］。SOD是一種含有金屬的參與氧化代謝的酶，是清除機體內有害自由基的重要物質［16］。MDA是膜脂過氧化的重要產物之一，可改變膜的通透性，進而產生一系列生理生化反應［17］。本次研究發現，模型組小鼠肝臟組織SOD活力下降而MDA含量上升，顯示膿毒癥小鼠肝臟抗氧化活性降低。而牛磺酸干預可提升膿毒癥小鼠肝臟SOD活力，降低MDA含量，表明牛磺酸可有效提高肝損傷小鼠的抗氧化活性。

外周血白細胞計數和中性粒細胞比例升高，淋巴細胞比率相對偏低，多見于各種細菌感染，特別是各種化膿性球菌，如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌感染。本次實驗顯示膿毒癥模型小鼠外周血淋巴細胞比率顯著下降，白細胞計數和粒細胞比率明顯上升，而牛磺酸干預后，這一現象得到了明顯的糾正，說明牛磺酸可明顯提升機體產生淋巴細胞的能力，降低炎癥性粒細胞的產生，對機體免疫系統產生良好調節作用。IL-10是一類由活化的單核細胞、T細胞、B細胞等分泌的高活性多功能多肽分子，又稱細胞因子合成抑制因子［18］。IL-10參與Th1向Th2的轉化，同時受到IL-6調節，維持機體免疫穩態，對炎性反應起到負向調控作用。此次研究顯示，牛磺酸干預可顯著提高IL-10的表達，降低機體炎性反應。

AKT屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的促生存激酶，參與細胞的生長與存活［19］。AKT的磷酸化可以激活下游的NF-κB，從而啟動IL-6、TNF-α等炎癥性細胞因子的產生［20-21］。NF-κB正常形態下以非活性狀態與IκB結合，當細胞受到LPS或促炎因子的刺激的時候，IκB降解并釋放NF-κB，NF-κB便可以由細胞質進入細胞核中，調節多種促炎細胞因子表達［22］。IL-6是NF-κB的靶標基因，有研究發現，LPS在體內可以通過髓分化因子88途徑活化NF-κB導致IL-6等炎癥因子釋放，IL-6含量升高，機體發生炎性反應［23］。同樣作為促炎性細胞因子，IL-1β可以通過泛素-蛋白酶體系統導致IκB降解，釋放的NF-κB轉移到細胞核中，激活靶基因的轉錄［24-25］。本次研究發現，牛磺酸干預后LPS炎癥小鼠肝臟AKT、NF-κB的蛋白表達均顯著降低，同時IκB表達上升，同時檢測血清中下游炎癥性細胞因子IL-6和IL-1β的表達下降，提示牛磺酸有可能是通過抑制AKT/NF-κB通路，促使更多的IκB與NF-κB結合從而抑制了下游炎癥因子的釋放，緩解膿毒癥小鼠肝臟的過度炎癥狀態。

綜上所述，牛磺酸有效減輕LPS所致膿毒癥肝損傷小鼠的炎性反應，提升肝臟抗氧化活性。牛磺酸可能通過抑制炎癥AKT/NF-κB信號通路，降低下游炎癥因子IL-6和IL-1β表達，從而達到抑制肝臟過度炎癥的良好效果。本研究為牛磺酸作為抗炎活性藥物的開發和利用提供可靠實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明胡玉蓮：醞釀和設計實驗，采集數據，分析/解釋數據，起草文章，對文章的知識性內容作批評性審閱；安佰麗：采集數據，支持性貢獻；劉超：統計分析，行政、技術或材料支持，支持性貢獻；高慧婕：醞釀和設計實驗，實施研究，分析/解釋數據，對文章的知識性內容作批評性審閱