有氧運動對ApoE-/-小鼠生物鐘基因Cry1表達的影響及其抗動脈粥樣硬化機制

程金鳳 孫大康 王倩倩 李洋 甄萌萌 程艷麗

1濱州醫學院附屬醫院，濱州 256600；2濱州醫學院附屬醫院醫學研究中心，濱州 256600；3臨邑縣人民醫院，德州 251500；4濱州醫學院附屬醫院心血管內科，濱州 256600

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥過程，脂質沉積和炎性反應是AS發病機制中重要的危險因素［1］。高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）的血清含量降低，總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量升高是促進AS發生的不利因素。在這些脂質中，LDL發揮著關鍵作用［2-3］。AS病變的發展開始于LDL對血管內膜滲透，積聚在內膜下的LDL被氧化為氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，OxLDL），導致和加劇內皮損傷；血液中的單核細胞遷移至損傷的動脈血管壁并黏附在內皮細胞，轉化為巨噬細胞，巨噬細胞吞噬OxLDL后形成泡沫細胞，進而形成最早的粥樣硬化病變脂質條紋［4-5］。AS斑塊中的局部炎癥主要由表達促炎介質的活化巨噬細胞介導［6］，在AS病變中，活化的巨噬細胞吞噬OxLDL后，最終會分泌白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎細胞因子，后者促進黏附分子的表達，刺激白細胞的募集，并破壞斑塊的穩定性，加劇AS發展［7-10］。

運動對抑制動脈粥樣硬化性心血管疾病的進展有顯著效果［11-13］，可能與其改善糖尿病、高血壓和高脂血癥等AS相關危險因素有關［14］，但是其確切的作用機制尚未完全闡明。生物鐘基因可參與調控AS的病理過程，其中，生物鐘基因Cry1（Cryptochrome 1）在AS過程中發揮保護作用，它可以通過調節機體的炎癥、血壓、糖脂代謝以及內皮細胞功能來影響AS的進展［15］。

我們課題組的轉錄組測序結果（尚未發表）發現，跑臺運動可以提高小鼠主動脈組織中Cry1基因的mRNA表達水平。據此我們提出假設，有氧運動可能通過誘導Cry1基因表達，進而調節脂質代謝及炎性反應，從而抑制AS的進程。本實驗中，我們用ApoE-/-小鼠建立AS模型，探討運動誘導的抗AS作用與Cry1基因表達之間的潛在聯系。

材料與方法

1.實驗動物

8周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠22只購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為：SCXK（京）2021-0006。動物飼養及實驗操作過程已通過濱州醫學院附屬醫院動物倫理委員會審批（20211101-95），采用國家標準嚙齒類動物飼料飼養，動物飼養符合每籠3～5只。飼養條件：通風條件良好，溫度：（25±1）℃，濕度：（55±5）%，每天12 h輪換照明。

2.實驗方法

研究實施時間：2022年3月至2022年11月。ApoE-/-小鼠隨機分為模型組（11只）和運動組（11只）。普通飼料適應性喂養1周后換用高脂飼料（40%脂肪+1.25%膽固醇）。模型組小鼠不干預其活動，運動組小鼠跑臺運動12周，5 d/周。運動方案如下：第1周適應階段，由6 m/min、30 min逐漸增加至12 m/min、60 min，之后進行穩定的運動量（12 m/min、60 min）。所有小鼠給予自由飲水，每2周對小鼠進行稱重并記錄其變化情況。

3.取材

運動結束并禁食12 h，用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉小鼠，血液樣本通過摘取眼球收集，離心后收集上清。經PBS溶液灌流后，游離主動脈弓至髂動脈分叉處的整段主動脈血管組織。將每組5只ApoE-/-小鼠的主動脈血管組織置于4%多聚甲醛固定液（paraformaldehyde，PFA）中，用于后續蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O染色及免疫組織化學染色；每組6只ApoE-/-小鼠取整段血管組織存于-80 ℃冰箱，用于后續real-time PCR分析。

4.炎癥因子及血脂水平測定

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度，試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供；比色法檢測小鼠血清中TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。測定嚴格按照說明書操作。

5.HE染色

組織經固定、脫水透明、浸蠟包埋后進行切片。厚度為4 μm，每隔10張取1張進行HE染色。切片按順序放入二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min，蘇木素浸泡2 min，分化液分化30 s，伊紅染色30 s，切片依次放入梯度酒精各3 s、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1 min進行脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡圖像采集，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行斑塊面積定量分析。

6.油紅O染色

組織固定脫水后使用OCT包埋制備冰凍切片，切片厚度為10 μm，每隔10張取1張進行油紅O染色。切片復溫干燥30 min，4% PFA固定10 min，蒸餾水洗，60%異丙醇浸潤5 min，油紅O染液浸潤10 min，蒸餾水洗，60%異丙醇溶液分化3 min，mayer蘇木素染液染色3 s，流水沖洗返藍，用甘油明膠進行封片，顯微鏡鏡檢并進行后續分析。

7.real-time PCR分析

用RNAiso Plus試劑從組織中提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒指示合成cDNA。按照CFX96 Real-Time PCR Detection system的操作方法，反應體系20 μl，擴增過程包括以下：95 ℃ 30 s，PCR反應，40 cycles，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。采用2-△△CT方法計算GAPDH、Cry1的相對表達量，見表1。

表1 目的基因的引物序列

8.免疫組化

常規制備石蠟切片，切片放入60 ℃烤箱中60 min，經二甲苯梯度脫蠟、各濃度乙醇溶液梯度脫水后，乙二胺四乙酸（EDTA）溶液高壓熱修復，滴加3%過氧化氫（H2O2）溶液孵育20 min，防止非特異性染色，山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min，一抗（Cry1 1∶100），4 ℃冰箱過夜。二抗37 ℃孵育30 min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，陽性區域呈棕黃色。蘇木素復染，酒精脫水，中性樹膠封片。顯微鏡圖像采集，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行平均光密度分析。

9.統計學分析

使用SPSS 25.0軟件操作，計量資料符合正態分布，以均數±標準差表示，運用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析進行統計學分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

1.有氧運動對ApoE-/-小鼠主動脈Cry1基因表達的影響

由圖1可知，運動組小鼠Cry1基因的mRNA表達水平明顯高于模型組（P＜0.01），表明有氧運動可以上調小鼠主動脈組織中Cry1基因的表達水平。此外，我們通過免疫組織化學染色進一步驗證了我們的假設，運動組小鼠主動脈組織中棕黃色顆粒較模型組表達增多（P＜0.01）。

圖1 有氧運動對ApoE-/-小鼠主動脈Cry1基因表達的影響。A：小鼠主動脈Cry1基因mRNA表達情況；B、C：小鼠主動脈Cry1蛋白表達情況及其平均光密度分析（免疫組織化學染色×400）

2.有氧運動對ApoE-/-小鼠血脂及炎性細胞因子的影響

與模型組小鼠相比，運動組小鼠經血清TC、TG、LDL-C水平降低（均P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.01），見表2；運動組小鼠炎性因子的水平較模型組顯著降低（均P＜0.01），見表3。

表2 兩組ApoE-/-小鼠血脂水平比較（mmol/L，）

表2 兩組ApoE-/-小鼠血脂水平比較（mmol/L，）

注：兩組小鼠普通飼料適應性喂養1周后換用高脂飼料（40%脂肪+1.25%膽固醇），模型組小鼠不干預其活動，運動組小鼠跑臺運動12周，5 d/周；TC為總膽固醇，TG為三酰甘油，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇；與模型組比較，aP＜0.01

HDL-C 0.84±0.20 1.12±0.14a組別模型組運動組只數11 11 TC 14.23±1.91 11.76±1.61a TG 2.62±0.33 1.28±0.24a LDL-C 3.33±0.20 2.80±0.32a

表3 兩組ApoE-/-小鼠炎癥因子水平比較（ng/L，）

表3 兩組ApoE-/-小鼠炎癥因子水平比較（ng/L，）

注：兩組小鼠普通飼料適應性喂養1周后換用高脂飼料（40%脂肪+1.25%膽固醇），模型組小鼠不干預其活動，運動組小鼠跑臺運動12周，5 d/周；IL為白細胞介素，TNF為腫瘤壞死因子；與模型組比較，aP＜0.01

TNF-α 484.47±41.75 441.89±22.53a組別模型組運動組只數11 11 IL-1β 95.67±7.51 86.56±6.78a IL-6 109.62±7.01 68.44±8.40a

3.有氧運抑制ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成

通過HE染色（圖2）可知，模型組小鼠主動脈內膜下有泡沫細胞形成，并且伴隨有脂質及膽固醇結晶的大量沉積，脂質斑塊明顯。而運動組斑塊面積明顯減少，斑塊內膽固醇結晶、泡沫細胞聚集情況有所減輕，AS斑塊占主動脈管腔橫截面的面積百分比也明顯降低（P＜0.01），見圖3。由油紅O染色可知，模型組AS斑塊形成明顯，脂質沉積情況顯著，12周跑臺運動后，運動組主動脈斑塊內的脂質含量明顯降低（P＜0.01），見圖4。

圖2 兩組ApoE-/-小鼠主動脈根部橫斷面HE染色（×200）

圖3 兩組ApoE-/-小鼠主動脈橫斷面斑塊面積定量分析

圖4 兩組ApoE-/-小鼠主動脈橫斷面油紅O染色（×100）（A）及斑塊內脂質含量定量分析（B）

4.有氧運動對ApoE-/-小鼠體質量的影響

實驗開始時，模型組和運動組ApoE-/-小鼠的體質量大致相同，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。隨著運動實驗的進行，兩組喂養高脂飲食的ApoE-/-小鼠體質量逐漸增加，并且在第8周開始出現顯著差異（P＜0.01），如圖5所示。

圖5 有氧運動對ApoE-/-小鼠體質量的影響

討論

運動可以抑制AS的進展［16-17］，但其確切機制尚未完全闡明。隨著研究的進一步深入，生物鐘基因Cry1成為抑制AS形成的重要因素［15，18］。但有氧運動與Cry1基因之間的聯系尚無相關研究。

1.有氧運動對ApoE-/-小鼠主動脈生物鐘基因Cry1表達的影響

我們對被廣泛應用于AS模型的ApoE-/-小鼠進行運動干預。參考運動干預影響ApoE-/-小鼠AS的相關研究資料，大多數研究者采用12～15 m/min、30～60 min/次的方案，本試驗確定了12 m/min、60 min/次的運動方案。在本研究中，有氧運動顯著提高了小鼠主動脈組織中Cry1基因的表達。由于Cry1基因在AS的發展中具有抑制作用，因此，我們推測有氧運動誘導的抗AS作用可能與Cry1基因表達的上調有關。

2.有氧運動誘導的Cry1基因表達升高通過調節炎性反應及脂質代謝抑制AS的形成

炎性反應會損傷血管組織，引起AS斑塊破裂和血栓形成［19-20］，是AS發生發展的重要危險因素。IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子在AS相關炎癥中發揮著重要作用。IL-1β被視為臨床治療AS中抗炎治療的潛在靶點。研究發現，與對照組小鼠相比，給予IL-1β拮抗劑干預的ApoE-/-小鼠主動脈血管斑塊面積減小，抑制了AS的進展［21］。IL-6參與調節急性期炎性反應和慢性炎癥［22］，在臨床研究中發現，冠心病患者血液樣本中IL-6的水平高于健康對照組［23］，并且冠心病患者病情的嚴重程度與IL-6水平呈正相關［24］。TNF-α也參與AS的發展，與ApoE-/-小鼠相比，TNF-α、ApoE雙敲除基因小鼠（TNF-α-/-，ApoE-/-）的AS斑塊面積更小，表明抑制TNF-α具有AS保護作用［25］。因此，降低這些炎性細胞因子的水平是AS抗炎治療的一個重要部分。在本研究中，運動組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著低于模型組，與Sun等［17］的研究結果一致。

在本研究中，我們評估了跑臺運動對AS斑塊形成的影響。模型組小鼠主動脈病理切片出現典型的AS表現。模型組主動脈切片顯示血管壁厚薄不均勻，存在大量泡沫細胞和AS斑塊，這一現象與Wu等［26］的研究相一致。與模型組小鼠相比，相同高脂飲食條件下的運動組小鼠經12周的跑臺運動干預后，其體質量和主動脈斑塊面積都有所下降。運動組小鼠主動脈管壁上仍有斑塊形成，但其脂質核心較小。并且，油紅O染色結果也顯示，運動組AS斑塊內的脂質沉積量小于模型組。我們還測量了小鼠血清中的血脂水平，運動組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平下降，血清HDL-C水平升高。但是在Wu等［26］的研究中，運動干預對小鼠血清TC、TG濃度的影響程度小，這與我們的實驗結果相矛盾。我們分析造成這種結果主要是由于兩個實驗過程中的運動模式、喂養時間和飲食配方不同。

本研究證明了跑臺運動的抗AS和抗炎作用，并且運動可以上調Cry1基因在動脈壁中的表達，阻礙ApoE-/-小鼠AS的進展。Narasimamurthy等［27］發現，在Cry-/-小鼠中，炎癥因子IL-6和TNF-α的表達顯著增加，這是因為生物鐘基因Cry1可以直接與腺苷酸環化酶結合抑制環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphatec，cAMP）的產生，從而抑制蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）誘導的p65磷酸化，進而抑制核因子（NF）-κB的激活降低炎性反應。當生物鐘基因Cry1缺失時可能會釋放其對cAMP產生的抑制作用，最終導致炎性反應的增加。然而，通過尾靜脈注射Cry1基因重組腺病毒載體使Cry1基因在ApoE-/-小鼠中高表達時，通過調節TLR/NF-κB通路，顯著降低了TNF-α、IL-1β和IL-6促炎因子的表達，緩解了AS的發生。此外，生物鐘基因Cry1過表達也減小了ApoE-/-小鼠的AS斑塊面積和TC、TG和LDL-C的濃度［18］。結合本實驗運動上調Cry1基因表達的結果，我們認為有氧運動誘導的Cry1基因表達升高是運動抑制AS形成的可能調控機制之一。有氧運動通過提高主動脈血管壁中生物鐘基因Cry1的表達，來發揮其抗炎及脂質調節的作用，進而抑制AS的進展。

有氧運動可以提高小鼠主動脈管壁生物鐘基因Cry1的表達水平，降低血脂及相關炎性因子的濃度，并抑制AS斑塊的形成，提示有氧運動的抗AS作用可能與其上調小鼠主動脈血管壁生物鐘基因Cry1的表達有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明程金鳳：醞釀和設計實驗，實施研究，采集數據，分析/解釋數據，起草文章，統計分析；孫大康：對文章的知識性內容作批評性審閱，行政、技術或材料支持，指導；王倩倩、李洋、甄萌萌：行政、技術或材料支持；程艷麗：對文章的知識性內容作批評性審閱，獲取研究經費，行政、技術或材料支持，指導