姜黃素對慢性顳葉內側癲癇大鼠腦脊液和血漿中MMP-9水平及血腦屏障通透性的影響

郭彩鳳 譚燕 張岳峰 周華榮 陳國華 方雅秀 藍曉鳳

廣州醫科大學附屬腦科醫院神經科，廣州 510370

癲癇（epilepsy）是大腦神經元異常放電引起的神經系統常見疾病［1］。癲癇的長期且頻繁發作會對患者的神經系統產生嚴重的損傷，對患者的身心健康及社會功能造成嚴重的影響［2］。

國內外研究發現，癲癇動物模型存在血腦屏障損傷［3-4］。而血腦屏障損傷程度與慢性癲癇大鼠癲癇發作頻次存在明顯相關［5］。有研究指出：減輕血腦屏障損傷程度、修復受損血腦屏障、改善血腦屏障功能有助于減少癲癇發作［6］。

血腦屏障的通透性及其功能的完整性與其血管內皮細胞間的緊密連接（tight junction）有著密不可分的關系［7］。緊密連接主要由閉鎖蛋白、緊密連接蛋白、claudins、跨膜蛋白和連接黏附分子組成［8］。其中，claudin-5是形成緊密連接初級結構的關鍵結構蛋白，它的分布和表達的變化可直接導致血腦屏障損傷［9］。基質金屬蛋白酶家族（MMPs）中的MMP-9已被證實可通過降解claudin-5進而導致血腦屏障損傷的發生［10］。除此之外，MMP-9也可通過降解緊密連接蛋白ZO-1進而破壞血腦屏障的結構［11］。

姜黃素是一種從姜黃屬類植物根莖中提取出來的多酚化合物［12］。其具有抗炎、抗氧化、保護或改善血管內皮功能等重要作用［13］。最近的研究發現，姜黃素可改變血腦屏障的通透性，并對血腦屏障起到保護作用［14］。然而，姜黃素是否會通過改變影響血腦屏障緊密連接的蛋白酶體系進而改變血腦屏障結構及功能仍是不明確的。

本研究通過對慢性顳葉內側癲癇大鼠給予姜黃素干預，進一步探究姜黃素對慢性顳葉內側癲癇大鼠癲癇發作情況的影響，同時探究姜黃素對慢性顳葉內側癲癇大鼠血腦屏障通透性以及影響血腦屏障緊密連接的MMP-9水平的影響，為進一步明確臨床上姜黃素改善血腦屏障功能及治療癲癇的可能性提供有力證據。

材料與方法

1.材料

1.1.藥物與試劑 姜黃素購自美國TargetMed公司（批號：T1534）。用二甲基亞砜把姜黃素溶解至200 g/L。鋰-匹羅卡品購自上海阿拉丁公司（批號：P129680，規格：250 mg）。白蛋白檢測試劑盒（BCG法）購自美國BioAssay Systems公司。大鼠MMP-9酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（貨號：XY0001H594）購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2.試驗動物 Sprague-Dawley大鼠購自廣東省實驗動物中心（SCXK2021-0002）（6～8周，雌性，體質量160～180 g），飼養在受控環境條件下（環境溫度24～25 ℃；濕度50%～60%；早上7點到晚上7點亮燈），自由獲得食物和水。

2.鋰-匹羅卡品誘導慢性顳葉內側癲癇大鼠

本研究于2021年2月至2023年2月在廣州醫科大學附屬腦科醫院開展。本研究的所有大鼠均采用目前國內外公認的成熟的化學點燃方法（即鋰-匹羅卡品誘導）構建顳葉內側癲癇模型［15］：先用鋰-匹羅卡品誘導大鼠出現癲癇持續狀態，經過一定的潛伏期后待大鼠出現反復自發性發作后。若癲癇持續狀態后2個月內出現至少2次反復自發性發作，則判定慢性顳葉內側癲癇模型構建成功。

3.分組及處理

將所有成功構建慢性顳葉內側癲癇大鼠隨機分為2組：姜黃素組及生理鹽水組，并做好標記。對于姜黃素組大鼠每天予以腹腔注射姜黃素溶液，給藥劑量為100 mg/kg，給藥體積為0.5 ml；生理鹽水組大鼠每天予以腹腔注射0.5 ml生理鹽水。干預期為4周。

4.癲癇發作監測

用錄像設備記錄各組大鼠的日常狀況，根據Racine評分系統評分細則對各組大鼠癲癇發作情況進行判斷并記錄。

5.腦脊液及血標本收集

各組大鼠在建模前、藥物干預前及藥物干預后分別收集腦脊液及血標本各500 μl，用于腦脊液和血漿中白蛋白及MMP-9的檢測。所有收集的血液樣本在進行檢測前均進行離心（3 000轉/min，10 min）并獲取血漿。

6.腦脊液及血漿標本中白蛋白和MMP-9水平檢測

使用ELISA對腦脊液及血漿標本中白蛋白和MMP-9濃度進行檢測。用于檢測大鼠腦脊液及血漿白蛋白濃度的ELISA試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司（貨號：RX302891R）。用于檢測大鼠腦脊液及血漿MMP-9濃度的ELISA試劑盒購自上海聯碩生物科技有限公司（貨號：AE90721Ra-96T）。根據各劑盒操作步驟進行各待測液中白蛋白及MMP-9水平的檢測。

7.統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布，以均數±標準差（）表示。兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，干預前后比較采用配對t檢驗。對于建模前、干預前、干預后的數據比較，我們采用了單因素方差分析進行，并進行了事后多重比較，以對比不同階段各組大鼠的各項指標的變化。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

32只大鼠中成功構建顳葉內側癲癇模型大鼠17只，隨其分為兩組。其中，姜黃素組9只，生理鹽水組8只。

1.干預前后兩組大鼠癲癇發作頻次改變（表1）

表1 干預前后兩組慢性顳葉內側癲癇大鼠反復自發性發作頻次比較（次/4周，）

表1 干預前后兩組慢性顳葉內側癲癇大鼠反復自發性發作頻次比較（次/4周，）

注：姜黃素組大鼠予以腹腔注射姜黃素（100 mg/kg）干預，生理鹽水組大鼠予以腹腔注射生理鹽水

組別姜黃素組生理鹽水組t值P值只數9 8干預前22.330±2.398 22.750±2.375 0.382 0.723干預后21.670±2.121 21.500±2.449 0.153 0.881 t值0.618 1.035 P值0.545 0.318

干預前兩組大鼠癲癇發作頻次差異無統計學意義（P＞0.05）。干預后，兩組大鼠癲癇發作頻次差異亦無統計學意義（P＞0.05），兩組大鼠癲癇發作頻次與干預前相比無顯著改變（均P＞0.05）。

2.建模前及干預前、后兩組大鼠白蛋白商變化情況（表2）

表2 建模前及干預前、后兩組慢性顳葉內側癲癇大鼠腦脊液及血漿中白蛋白濃度變化（）

表2 建模前及干預前、后兩組慢性顳葉內側癲癇大鼠腦脊液及血漿中白蛋白濃度變化（）

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建模前，兩組大鼠腦脊液白蛋白濃度、血漿白蛋白濃度、白蛋白商（白蛋白商=腦脊液白蛋白濃度/血清白蛋白濃度）差異均無統計學意義（均P＞0.05）。建模成功后，兩組大鼠的腦脊液白蛋白濃度及白蛋白商均高于建模前（均P＜0.05）。給予不同的干預后，姜黃素組大鼠的白蛋白商較干預前顯著下降（P＜0.05），而生理鹽水組干預前、后的白蛋白商差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.建模前及干預前、后兩組大鼠腦脊液、血漿中MMP-9變化情況（表3）

表3 建模前及干預前、后兩組慢性顳葉內側癲癇大鼠腦脊液及血漿中MMP-9變化情況（μg/L，）

表3 建模前及干預前、后兩組慢性顳葉內側癲癇大鼠腦脊液及血漿中MMP-9變化情況（μg/L，）

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建模前，兩組間腦脊液和血漿中MMP-9濃度差異均無統計學意義（均P＞0.05）。建模成功后（干預前），兩組大鼠腦脊液中MMP-9濃度均顯著高于建模前（均P＜0.05）。給予干預后，姜黃素組大鼠腦脊液中MMP-9濃度較干預前顯著降低（P=0.027）。與此同時，該組大鼠血漿中MMP-9濃度也有下降的趨勢，但該變化差異無統計學意義（P＞0.05）。而生理鹽水組無論是腦脊液中還是血漿中MMP-9濃度與干預前相比，干預后均無顯著改變（均P＞0.05）。

討論

自1970年起，陸續有研究報道癲癇會影響血腦屏障的完整性及功能［16］。在動物模型中發現，在癲癇發作后的幾分鐘內，血腦屏障便出現不同程度的損傷，這種損傷可持續數小時甚至數天［3］。van Vliet等［6］的研究發現癲癇持續狀態會導致血腦屏障損傷的發生，并且這種損傷的發生和發展會蔓延至慢性期，持續時長達數周至數個月不等。此外，該研究還發現血腦屏障的損傷一定程度上影響著癲癇發作的頻次。這提示癲癇病情的持續可能與血腦屏障的損傷有關。

姜黃素作為從姜黃屬類植物根莖中提取出來的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等功能，對神經系統、心血管系統等均有著保護作用［17］。本研究發現：給予姜黃素干預后，模型鼠白蛋白商（腦脊液白蛋白/血漿白蛋白比值）較干預前顯著下降。這提示姜黃素在一定程度上改變了血腦屏障的通透性，這與先前的研究結果是相類似的。既往的研究表明，姜黃素可以降低氧化應激反應造成的神經系統損傷，并對受損的血腦屏障起到修復作用［18］。與此同時，本研究還發現姜黃素對腦脊液MMP-9水平有著顯著的影響。而既往的研究已經指出：MMP-9可降解緊密連接中重要組成部分——claudin-5和ZO-1，從而降低血腦屏障的結構完整性，進而造成血腦屏障通透性改變和血腦屏障損傷［11］。因此，姜黃素除了通過減少因氧化應激反應造成的血腦屏障損傷外，還可能通過調節影響緊密連接結構的蛋白酶表達水平進而對血腦屏障起到保護作用。

此外，本研究結果顯示：姜黃素并未對慢性顳葉內側癲癇大鼠癲癇發作頻次起到顯著的影響。既往的研究結果表明：白蛋白通過破損的血腦屏障進入大腦細胞外空間后可誘導星形膠質細胞中的轉化生長因子（TGF）-β/ALK5信號通路的激活，進而誘導興奮性的突觸形成，從而導致自發性癲癇的發生［19］。而當使用AT1受體拮抗劑阻斷TGF-β信號通路后，有效抑制了大腦細胞外間隙中的白蛋白對腦內TGF-β通路激活的誘導作用，從而達到減少自發性癲癇發作的作用［20］。因此，血腦屏障受損修復后，白蛋白從血液中滲入腦內減少，從而一定程度地抑制癲癇發作。本研究中，所有模型鼠在接受姜黃素干預前已經存在血腦屏障損傷，即已存在白蛋白從血液中滲入到腦內的現象。而模型鼠接受姜黃素干預的時間是相對局限的，僅有14 d時間。雖然結果顯示姜黃素對血腦屏障損傷程度有所逆轉，但逆轉的程度是否已經到達有效抑制白蛋白從血液中向腦內滲透的程度仍是不確定的。此外，姜黃素可能是通過對血腦屏障損傷進行修復并減少刺激因素——白蛋白入腦，進而進一步抑制癲癇發生，而并不一定對干預前已滲入到腦內并可引起癲癇發作的白蛋白起到清除作用。在有限的干預時間內，姜黃素的修復效果還未達到完成修復且腦內滲入的白蛋白仍未被有效清除，模型鼠的癲癇發作狀況也可能因此而未有明顯改善。因此，姜黃素對癲癇發作的影響是否受到療程和治療劑量的影響仍需進一步研究和探討。

姜黃素可能通過改變腦脊液中MMP-9水平來改變慢性顳葉內側癲癇大鼠血腦屏障緊密連接的結構和功能，從而改變血腦屏障的通透性，進而對受損的血腦屏障起到一定的修復作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明郭彩鳳：起草文章，獲取研究經費；譚燕：行政、技術或材料支持，支持性貢獻；張岳峰：行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻；周華榮：分析/解釋數據；陳國華：采集數據；方雅秀：分析/解釋數據；藍曉鳳：醞釀和設計試驗，實施研究，對文章的知識性內容作批評性審閱，獲取研究經費