甘蔗渣制備低聚木糖的工藝優化*

張 婷,孫德嬌,王彩衣,黃 鑫,陳少強,黎飛望,楊 齊

(1.南寧學院食品與質量工程學院,廣西南寧 530200;2.廣西多得樂生物科技有限公司,廣西南寧 530028)

低聚糖是由2-10個單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物,分子量為300-2 000,其種類較多,常見的有低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖等[1]。其中,功能性低聚糖具有獨特的益生元活性、工藝特性和生理效應,能促進腸道內益生菌生長、改善腸道功能、維持腸道菌群平衡以及作為糖脂和糖蛋白組成部分參與人體正常機能等,因此,功能性低聚糖常被應用于食品和保健品等行業[2-4]。與其他低聚糖相比,低聚木糖具有成本低、穩定性好等優勢,能夠極大地刺激雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)和乳酸菌(Lactobacillussp.)的生長,因此在食品配料方面具有很大的潛力[5]。

玉米芯、甘蔗渣、稻草、麥麩等農業廢棄物中富含木質纖維素,木質纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質素,其中,甘蔗渣含有纖維素32%-45%、半纖維素20%-32%和木質素17%-32%[6]。半纖維素的主要組成成分是木聚糖,且商業低聚木糖的原料通常來自木質纖維素中的木聚糖,因此,甘蔗渣可以作為廉價的生產原料,通過自水解、化學法、物理法和酶促法制備低聚木糖[7]。相較于自水解、化學法和物理法,酶促法反應更加溫和,生產過程綠色環保,更適合工業化生產的需求[7]。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)作用于木聚糖主鏈內的糖苷鍵,但由于甘蔗渣內纖維素、半纖維素和木質素這3種主要成分相互交聯形成網狀結構,木聚糖酶很難透過網狀結構結合到木聚糖上進行水解反應,因此必須對甘蔗渣進行適當的預處理[8,9]。甘蔗渣預處理的方法包括常規(物理、化學、生物、機械、熱化學)和非常規(離子液體/電)預處理,如高濃度堿處理甘蔗渣(Alkali treated Sugarcane Bagasse,ASB)或蒸汽爆破預處理等,不僅不夠環保,而且前期投資大、能耗高,均無法滿足大規模工業制備需求[10-12]。堿處理能夠破壞木質素的結構,削弱木質素和纖維素、木聚糖之間的氫鍵及化學聯系,從而導致纖維素和木聚糖暴露以及木聚糖溶解;酸處理則有助于溶解和破碎纖維素原纖維和半纖維素[13]。本研究首先通過低濃度堿/酸處理法提取甘蔗渣中的木聚糖,然后利用木聚糖酶對提取出的木聚糖進行酶解,并對堿/酸處理條件及酶解條件進行單因素試驗,最后通過響應面法對木聚糖酶的酶解工藝進行優化。該工藝是一種從木質纖維素生物質中制備低聚木糖的潛在策略,為甘蔗渣的高值化利用以及更好地制備低聚木糖提供了新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗渣來自廣西糖業集團良圻制糖有限公司,經干燥粉碎后過80目篩備用。經測定,甘蔗渣樣品中含有纖維素43.7%,木質素22.1%,木聚糖21.2%。KOH、濃H2SO4、甲醇、蛋白胨、酵母提取物、NaCl等均購自國藥集團化學試劑有限公司;D-(+)-木糖(色譜純,純度≥98%)、低聚木糖(聚合度為2-6;色譜純,純度≥98%)標準品、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等均購自北京索萊寶科技有限公司。木聚糖酶rAfxynA為木聚糖酶基因AfxynA的大腸桿菌(Escherichiacoli)表達產物,其最適作用溫度為50 ℃,最適作用pH值為7.0[14]。

1.2 低聚木糖的生產工藝

將甘蔗渣粉末與KOH溶液(0.1-0.5 mol/L)混合,于高溫(90-130 ℃)下處理0.5-2.5 h以脫除木質素,然后用水沖洗甘蔗渣至中性并烘干,得到ASB[13]。將ASB與H2SO4溶液(0.05-0.25 mol/L)混合以進行酸水解,在50-90 ℃下處理0.5-2.5 h,然后調節混合液pH值至中性并加入10-50 U/g ASB木聚糖酶進行酶解反應,在30-55 ℃下處理2-10 h。最后,通過高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法檢測酶解產物中低聚木糖和木糖的含量并計算其產率。

1.3 堿處理單因素試驗

準確稱取甘蔗渣粉末10 g,裝入500 mL三角瓶中,按固液比1∶10 g/mL加入KOH溶液,充分混勻后密閉瓶口,置于高壓蒸汽滅菌鍋中進行堿處理。選取KOH濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)、堿處理溫度(90、100、110、120、130 ℃)、堿處理時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h) 3個因素進行單因素試驗,按照1.2節的工藝得到ASB,檢測ASB中木質素脫除率和木聚糖保留率。

1.4 木質素脫除率和木聚糖保留率的檢測

根據Sluiter等[15]的方法檢測甘蔗渣中木質素和木聚糖的含量,計算木質素脫除率和木聚糖保留率。將0.3 g甘蔗渣與3 mL 72% (V/V) H2SO4混合,然后在30 ℃下孵育1 h,用去離子水將H2SO4濃度稀釋至4% (V/V)后,于121 ℃、105Pa下孵育1 h,使用過濾坩堝進行固液分離,并在121 ℃下干燥固體部分至恒重。隨后,將干燥固體在575 ℃的馬弗爐(上海黔通儀器科技有限公司)中放置4 h,稱量殘留物即得灰分質量。不溶性木質素的質量則由干燥固體質量減去灰分質量而得。此外,濾液中的酸溶性木質素使用SynergyTMH1自動酶標儀(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,VT,USA)在240 nm處進行測定。采用HPLC測定濾液中木糖的濃度[13],以78%乙腈為溶劑,在溫度30 ℃、流速為1.0 mL/min的條件下進行等密度洗脫,計算得到濾液中木糖的含量,木糖的含量乘以0.88換算出木聚糖的含量。本研究以木質素脫除率和木聚糖保留率的總和(Y/%)作為衡量堿處理效果的指標,公式如下:

木質素脫除率(%)=

100%,

木聚糖保留率(%)=

1.5 酸處理單因素試驗

向ASB中加入H2SO4溶液,固液比為1∶10 g/mL,充分混勻后進行酸處理。選取H2SO4濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L)、酸處理溫度(50、60、70、80、90 ℃)、酸處理時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h) 3個因素進行單因素試驗,按照1.2節工藝進行后續的酶解反應,最后檢測酶解產物中低聚木糖和木糖的產量,并計算低聚木糖和木糖的產率。

1.6 低聚木糖和木糖產率的計算

ASB中的木聚糖含量參考1.4節的方法進行測定,酶解后的低聚木糖和木糖通過HPLC進行測定,以78%乙腈為溶劑,在溫度30 ℃、流速為1.0 mL/min的條件下進行等密度洗脫,根據峰面積計算得到低聚木糖和木糖的濃度,再乘以酶解反應體系的體積,得到低聚木糖和木糖的產量,按照下列公式計算低聚木糖和木糖的產率。

低聚木糖產率(%)=

1.7 木聚糖酶酶解的單因素試驗

將酸處理之后的甘蔗渣固液混合物調整pH值至7.0,然后加入木聚糖酶,在水浴鍋中振蕩酶解,選取木聚糖酶用量(10、20、30、40、50 U/g ASB)、酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)、酶解時間(2、4、6、8、10 h) 3個因素進行單因素試驗,按照1.6節的方法檢測酶解產物中低聚木糖和木糖的產量,并計算低聚木糖和木糖的產率。

1.8 木聚糖酶酶解的響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上,確定影響木聚糖酶水解的各因素的最佳用量范圍,以此設計響應面試驗,分別以酶解時間(A)、酶解溫度(B)和酶用量(C)作為自變量,低聚木糖的產量作為因變量,各因素水平編碼見表1。

1.9 數據處理

采用Microsoft Excel(Office 2021)和Design Expert 8.0軟件進行數據處理、分析及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 甘蔗渣堿處理的單因素試驗結果

堿處理對木質素脫除率和木聚糖保留率的影響如圖1所示。由圖1(a)可知,隨著KOH濃度的增加,木質素脫除率逐漸上升,而木聚糖保留率則逐漸下降;Y值呈先增加后降低的趨勢,且KOH溶液濃度為0.3-0.4 mol/L時,Y值達到最大值。為了節約生產成本和降低后續處理的難度,選擇0.3 mol/L的KOH溶液作為最佳的堿處理濃度。由圖1(b)可知,隨著溫度的升高,木質素脫除率逐漸上升,而木聚糖保留率則逐漸下降;同時,Y值呈先增加后降低的趨勢,并且在110-120 ℃時達到最大值。為了減少能耗,選擇在110 ℃對甘蔗渣進行脫木質素預處理。由圖1(c)可知,隨著堿處理時間的延長,木質素脫除率逐漸增加,木聚糖保留率不斷減少;Y值呈先增加后降低的趨勢,在1.5 h達到最大值。因此,選擇1.5 h作為甘蔗渣堿處理的時間。最終,將甘蔗渣在0.3 mol/L的KOH溶液、110 ℃處理1.5 h后,木質素脫除率為57.8%,木聚糖保留率為87.4%。

圖1 堿處理對木質素脫除率和木聚糖保留率的影響

2.2 ASB酸處理的單因素試驗結果

酸處理對低聚木糖和木糖產率的影響如圖2所示。由圖2(a)可知,隨著H2SO4濃度的增加,木糖產率不斷增加,低聚木糖的產率呈先增加后降低的趨勢。當H2SO4濃度為0.10 mol/L和0.15 mol/L時,低聚木糖的產率分別為37.6%和37.4%,低聚木糖的產率在這兩個濃度間達到最大值。為了降低生產成本和后續處理的難度,選擇使用0.10 mol/L的H2SO4溶液對堿處理后的甘蔗渣進行處理。由圖2(b)可知,隨著酸處理溫度的升高,木糖產率不斷增加,低聚木糖的產率呈先增加后降低的趨勢;當溫度為80 ℃時,低聚木糖的產率達到最大值(45.5%),隨后開始下降,故選擇80 ℃作為酸處理的溫度。由圖2(c)可知,隨著酸處理時間的延長,木糖產率不斷增加,低聚木糖的產率呈先增加后降低的趨勢;酸處理時間為1 h時,低聚木糖的產率達到最大值(44.6%),隨后開始下降,故選擇1 h作為酸處理的時間。

圖2 酸處理對低聚木糖和木糖產率的影響

2.3 木聚糖酶酶解的單因素試驗

如圖3(a)所示,隨著酶用量的增加,低聚木糖的產率也逐漸增加,當酶用量達到20 U/g ASB時,低聚木糖的產率開始緩慢下降。因此,選擇20 U/g ASB的酶用量進行酶解試驗。如圖3(b)所示,隨著溫度的升高,低聚木糖的產率先增加后緩慢下降,在40 ℃時低聚木糖的產率達到最大值。因此,為取得較好的酶解效果,選擇40 ℃作為酶解溫度。如圖3(c)所示,隨著酶解時間的增加,低聚木糖的產率呈先增加后緩慢降低的趨勢,4 h時低聚木糖的產率最大。因此,選擇4 h作為酶解時間。

圖3 酶解處理對低聚木糖產率的影響

2.4 木聚糖酶酶解的響應面優化試驗

2.4.1 響應面試驗結果與分析

通過Design Expert 8.0軟件對表2的試驗結果建立數學模型,得到二次多元回歸方程:

表2 響應面試驗結果

Y=-39.18333+1.86667A+1.88167B+0.89333C-0.075AB-0.075AC+0.011BC-0.16146A2-0.025833B2-0.029833C2。對試驗結果進行回歸方程分析和方差分析(表3),從分析結果可以看出,試驗模型P<0.05,說明該方程模型具有顯著意義。失擬度為0.111 3,相對純誤差而言影響不顯著(P>0.05),說明該方程擬合情況良好,表明實驗數據能夠較好地反映各因素與低聚木糖產量的關系。根據回歸方程系數顯著性檢驗可以看出,木聚糖酶用量對低聚木糖產量的影響最大,其次為酶解時間,酶解溫度的影響最小。

表3 回歸模型的顯著性分析

2.4.2 響應面的交互作用分析

采用Design Expert 8.0軟件繪制三維響應曲面圖(圖4)。根據響應面結果可知,低聚木糖的產量均隨著酶解溫度、酶解時間和酶用量的增加呈先增加后減少的趨勢;并且在圖4(b)和圖4(c)中,酶用量形成的曲面較為陡峭,表明酶用量對低聚木糖產量的影響較酶解時間和酶解溫度更為顯著。

圖4 各因素交互作用的3D響應曲面

2.4.3 響應面優化結果驗證

根據響應面分析結果,木聚糖酶酶解的最優工藝為酶解時間4.33 h,酶解溫度40.45 ℃,酶用量21.89 U/g ASB,預測得到的低聚木糖產量為12.69 g/L。為方便實際操作,將工藝條件進行微調,設置酶解時間為4.3 h,酶解溫度為40.5 ℃,酶用量為22 U/g ASB,以此條件進行驗證試驗,重復3次,得到低聚木糖的產量分別為12.62、12.71、12.65 g/L,取平均值12.66 g/L,這與預測結果基本相符。

3 討論

為了高效水解甘蔗渣中的木聚糖以進行低聚木糖的制備,眾多研究者對甘蔗渣進行了不同方法的預處理。常見的低聚木糖生產工藝為首先采用高濃度堿提取甘蔗渣中的木聚糖,然后采用酶解的方法進行制備。如韋杰等[16]用8.56%的NaOH抽提甘蔗渣中的木聚糖,蔣隨新等[17]使用10%的KOH提取甘蔗渣中的木聚糖,這一工藝存在的問題主要是高濃度的堿抽提木聚糖的同時溶解了大量的木質素,后續還需進一步分離木質素和木聚糖,且后續堿的回收困難,廢水處理壓力大,導致生產成本居高不下。NaOH雖然已廣泛用于木質纖維素的預處理,但是廢鈉處理會造成水污染和土壤鹽堿化;KOH對木質纖維素生物質的活性與NaOH相當,重要的是,經KOH預處理后的廢液中含有豐富的鉀離子,可以作為植物肥料[13]。Zhao等[13]研究表明,在KOH濃度1.9%、溫度120 ℃、處理時間50 min的條件下木質素去除率可達到76.7%,木聚糖回收率為64.2%。此外,也有研究者采用其他方法對甘蔗渣進行預處理,如楊淑娟等[18]采用NaOH-乙醇對甘蔗渣進行預處理,此處理條件下木質素的脫除率達到78.1%。而本研究采用0.3 mol/L KOH (1.68%)進行處理,木質素脫除率達到57.8%,低于上述研究結果;但本研究的木聚糖保留率達到87.4%,顯著高于Zhao等[13]的研究結果。本研究的堿處理條件不僅減少了廢水處理壓力,而且高木聚糖保留率更利于后續低聚木糖的生產。

本研究制備低聚木糖采用的工藝為甘蔗渣堿脫木質素-稀酸水解-木聚糖酶酶解,其中,堿處理能夠破壞木質纖維素的內在結構從而去除木質素,釋放纖維素和木聚糖,并促進木聚糖的溶解;酸溶液對木質素的去除效果不佳,主要用于溶解木聚糖[13,19]。趙志剛等[19]利用NaOH、H2O2和稀硫酸對甘蔗渣進行預處理,然后使用纖維素酶對預處理的甘蔗渣進行酶解,結果證實酸堿處理可以有效去除木質素并釋放木聚糖,這與本研究處理方法類似。在用堿脫除甘蔗渣木質素的過程中,堿濃度對木聚糖的溶解性影響較大。Khaleghipour等[10]研究表明在2 mol/L NaOH、121 ℃、60 min的條件下木聚糖和木質素的溶解率分別達到85.6%和84.1%,不利于用木聚糖制備低聚木糖,因此還需將溶解的木質素進行二次分離。本研究發現,增加堿濃度、延長堿處理時間或者提高堿處理溫度都會導致木質素脫除率的持續增加和木聚糖保留率的持續降低,這與Khaleghipour等[10]的報道一致。

本研究在酶解之前要先進行低強度的酸水解,結果發現,隨著酸濃度和酸處理溫度的增加以及處理時間的延長,木糖的產率會持續增加,而低聚木糖的產率則呈先增加后減少的趨勢。Akpinar等[20]對比了木聚糖酸水解與酶解兩種處理方式,發現酸水解的產物不易控制,而且酸水解的時間越長,木糖產率越高,不利于低聚木糖的產生,這進一步說明酸處理對木聚糖水解產物具有不確定性,但其具體影響機制還有待進一步研究。

與其他已報道的酶解反應相比,本研究工藝在相同的低聚木糖產率下用時更短或用酶量更少。段永忠等[21]研究表明,在50 ℃恒溫水浴、pH值為5.4的最適反應條件下,向底物濃度為1.47%的甘蔗渣中加入1 000 IU/g底物的木聚糖酶反應1 h后,低聚木糖的得率占可溶性總糖的30%。而本研究在酶用量22 U/g ASB、酶解時間4.3 h、酶解溫度40.5 ℃的條件下,低聚木糖的產率超40%,產量達到12.66 g/L。類似地,Jayapal等[22]提出的工藝中酶用量為13.2 U/g底物,比本工藝酶用量略低,但耗時更長。此外,本研究中低聚木糖的產率隨酶用量的增加而增加,并逐漸趨于不變甚至降低的趨勢,這一現象與歐陽嘉等[23]和Silva等[24]的研究結果一致?？赡苁怯捎谀揪厶敲缸饔糜谀揪厶侵麈渻鹊奶擒真I,隨著木聚糖酶添加量的增加,水解效率增大,低聚木糖的產率增加,而當底物濃度達到一定時,酶解反應趨于平衡,過量的酶可能會繼續水解低聚木糖生成木糖,導致低聚木糖的產率不再增加甚至降低[23,24]?？偟膩碚f,本研究仍存在一些不足之處,比如如何解除酶解反應的平衡、提高低聚木糖的產量或者是去除酶解產物中的木糖,后續還需對其進行深入研究和探索,這也是本研究下一步的工作方向。

4 結論

本研究采用低濃度堿脫木質素-低強度酸水解-木聚糖酶酶解的方法優化甘蔗渣制備低聚木糖的工藝,結果表明甘蔗渣經0.3 mol/L的KOH溶液在110 ℃處理1.5 h后,木質素的脫除率能夠達到57.8%,同時木聚糖的保留率達到87.4%;堿處理甘蔗渣經適當酸水解后,添加22 U/g ASB的木聚糖酶于40.5 ℃酶解4.3 h,可得到12.66 g/L的低聚木糖。優化后的工藝條件為從甘蔗渣中高效制備低聚木糖提供了理論指導。