煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在卵母細胞成熟及受精激活中的作用

黃麗雙，劉蕓

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院婦產科生殖中心,福州 350025;2.福建醫科大學福總臨床醫學院,福州 350025)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)簡稱輔酶Ⅱ,廣泛存在于細胞質中尤其是線粒體內,作為電子轉移載體為人們所熟知。線粒體NADP的產生依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)激酶2(NAD kinase 2,NADK2)對NAD的磷酸化[1]。NADP參與線粒體中三磷酸腺苷(ATP)的合成[2],為卵母細胞受精、胚胎發育提供所需能量。此外,NADP(H)與NAD(H)對細胞質與線粒體中的氧化還原電勢共同發揮雙向性作用[3],并進一步影響胚胎氧化應激水平及其發育狀況;作為多種細胞內生物酶的底物,NADP可直接調節酶的作用[4]。線粒體鈣振蕩與卵母細胞內鈣振蕩息息相關,NADP在線粒體鈣活動中的作用機制缺乏相關研究。近年來,有研究發現,NADP在海星卵母細胞受精之前就能有效誘導胞漿內Ca2+升高[5],但其機制未明,值得進一步研究。

一、NADP參與卵母細胞成熟、受精及胚胎早期發育過程中的能量調節

線粒體是卵母細胞胞質中含量最豐富的細胞器。生物氧化的場所在線粒體,由呼吸鏈傳遞。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)-泛醌還原酶位于線粒體的內側,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)常位于線粒體的外側,與NADH具有相同的功能。呼吸鏈中電子由NADPH傳遞給泛醌,線粒體中的NADH/NADPH在氧化磷酸化作用下生成ATP[6]。

NADP參與線粒體呼吸鏈是卵母細胞及早期胚胎所需能量的最直接來源。在胚胎的生發泡破裂及第一極體的排出這兩個重要細胞事件中可觀察到ATP峰的產生。受精后,第二極體排出及原核形成過程中,NADP通過ATP的合成來參與受精過程中的這兩項生理活動。在第二極體排出過程中,細胞質的分裂需要微絲協助并消耗能量;而在雌雄原核的核膜、核孔復合體的重構過程中,也同樣需要微管微絲的協助并消耗能量[7-8]。已有研究表明,在卵母細胞和胚胎發育過程中,ATP含量低會導致染色體分離異常,非整倍體形成[9]。此外,ATP不足還會降低卵母細胞質量,更導致植入前胚胎質量及種植率的下降。相反,卵母細胞和胚胎中ATP含量越高,生殖助孕的患者妊娠結局越好[10]。來自卵母細胞線粒體移植的研究證實,將年輕婦女的卵母細胞線粒體移植到老齡婦女的卵母細胞胞質中,后者的ATP含量明顯升高,并改善了卵母細胞及胚胎發育能力[11]。可見,線粒體的活性與含量不僅決定卵母細胞質量,還影響卵母細胞受精及發育能力,而NADP作為線粒體產能的底物,對卵母細胞意義重大。

二、NADP對胚胎氧化應激水平及其發育狀況的影響

NADPH作為強還原劑在合成代謝途徑中發生,NADP/NADPH可反應活細胞中氧化還原電勢[12]。NADP/NADPH比率保持較低,有助于活性氧(ROS)的清除[8,13]。從生發泡(germinal vesicle,GV)期至MⅡ期(第2次減數分裂),直至8細胞之前的胚胎多利用磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)進行葡萄糖代謝,并產生NADPH。NADPH可合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)保護細胞免受ROS損傷[14]。囊胚期時胚胎糖酵解阻滯緩解,葡萄糖通過糖酵解途徑氧化生成ATP,同時產生ROS[15]。線粒體是產生內源性ROS的主要場所,也是ROS攻擊的主要靶點。生理狀態下,ROS在卵母細胞發育中發揮著細胞內信號傳導的作用,增強卵母細胞的發育潛能;但過量ROS對線粒體有毒性作用,主要表現為線粒體膜磷脂被氧化和電子傳遞鏈被破壞,從而影響細胞色素C氧化酶和ATP合成酶的活性,使氧化磷酸化不能正常進行,ATP產生迅速減少,并引起線粒體進一步的損傷[15],從而可導致卵母細胞脆弱性增加,導致紡錘體不穩定、染色體異常、端粒縮短以及衰老的卵母細胞發育能力下降[16]。研究顯示,高蔗糖飲食的嚙齒動物與禁食的嚙齒動物相比,胞質溶膠中的未結合NADP/NADPH比率增加近五倍至八倍[17];而肥胖中常見的脂質和吡啶核苷酸代謝紊亂會損害內質網鈣吸收,從而導致內質網應激、破壞鈣穩態[18-19]。在衰老、腫瘤與炎癥反應過程中,無論是病理機制研究或是治療,NADP作為NAD的代謝產物,其抗氧化、修復作用越來越受各個領域的關注[20]。

三、NADP參與卵母細胞內多種代謝通路的調節

NADP參與卵母細胞氧化代謝相關途徑。Downs等[21]在1999年研究發現,當使用NADP依賴酶抑制劑作用于PPP時,小鼠卵丘復合物(COC)成熟度降低,這意味著該途徑的葡萄糖代謝對減數分裂誘導至關重要。此外,在牛COC及豬COC中同樣有報道,PPP通路影響卵細胞核成熟等進而影響卵母細胞質量[22-23],PPP可能參與減數分裂所有階段的進展,包括減數分裂的恢復、MI～MⅡ過渡和受精后減數分裂的恢復[23]。有研究發現,NADP處理后的體外成熟牛卵母細胞雖然完成了減數分裂和胞質成熟過程,但NADP通過刺激PPP通路增加氧化和線粒體活性,并延遲線粒體遷移,使囊胚形成率下降[24];同樣地,關于豬COC的體外成熟培養研究中也得出了與上述牛卵母細胞較為一致的結果[25],提示NADP的添加影響了卵母細胞的發育潛能。

據報道,在體外成熟的牛卵母細胞和卵丘細胞中,參與氨基酸代謝和三羧酸循環的NADP依賴的異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)單位保持恒定,并在卵母細胞中檢測到高NADP-IDH活性;另外,添加異檸檬酸+NADP的成熟培養基可增加成熟卵母細胞的百分比,而將NADP換成檸檬酸鹽的情況下,不能提高卵母細胞的成熟率,說明NADP在卵母細胞成熟過程中發揮重要作用[26]。

四、NADP對卵母細胞內鈣離子的作用

NADP是煙酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate,NAADP)的類似物,還是NAADP的前體,CD38催化NADP合成NAADP[27]。NAADP也是第二信使,可從細胞內鈣庫動員鈣離子,調節鈣離子信號傳導。目前研究結果顯示,NAADP介導的Ca2+動員可能與內質網介導的Ca2+動員完全不同,是一種來源于酸性細胞器上的ATP依賴性的Ca2+攝取,可能有未知機制參與其中[28-30]。研究發現,NADP通過CD38合成的NAADP可介導溶酶體Ca2+信號失調,造成神經元功能障礙,在神經退行性疾病發病機制中發揮重要作用[31];但NADP本身在神經退行性疾病中的作用有待進一步發掘。Takahashi等[5]研究發現,在生發泡破裂(GVBD)前的成熟卵母細胞存在三磷酸肌醇誘導的鈣釋放(IICR)以外的Ca2+釋放機制,依賴于NADP的鈣釋放;成熟卵母細胞中NADP依賴性Ca2+釋放本身并不能誘導卵母細胞成熟,其發展可能歸因于成熟相關的胞漿Ca2+和pH值的增加,該過程可能代表卵母細胞對促卵母細胞成熟激素的生理反應。

線粒體Ca2+攝取的主要來源為卵母細胞內作為鈣儲庫的內質網。內質網與線粒體之間Ca2+傳遞異常可同時造成內質網應激與線粒體應激,在卵泡的選擇性發育、卵母細胞成熟中發揮間接作用[32]。但NADP作為線粒體氧化磷酸化底物,在其中的作用機制缺乏相關研究。研究發現,線粒體可調節受精過程中的鈣振蕩,通過增加鈣振蕩來誘發氧化磷酸化產生ATP[33-35],而線粒體產生ATP又可以支持胞質內的鈣離子迅速轉入內質網中,維持鈣振蕩正常模式[36-37]。同時,線粒體在Ca2+振蕩過程中吸收Ca2+,啟動自身振蕩,刺激線粒體氧化還原狀態,增加GV期卵母細胞的ATP水平[38];線粒體Ca2+超載可導致小鼠卵母細胞線粒體氧化應激和減數分裂恢復延遲[39]。研究發現,Erastin和CGP37157均可顯著抑制線粒體Ca2+通道,可使卵母細胞原核形成發育受阻[40]。已有許多研究發現衰老對鈣振蕩模式的影響,如老化影響鈣瞬變的頻率、振幅、持續時間和鈣離子增加/減少的動力學、鈣離子振蕩的總持續時間。近年來研究者們發現衰老會降低線粒體的功能,影響受精后卵母細胞內內質網和線粒體的分布,從而影響ATP依賴的Ca2+瞬變的產生,并由此解釋Ca2+振蕩模式的一些改變[41]。

綜上所述,NADP不僅于細胞增殖、細胞分化、細胞內物質轉運時表現得相當活躍,是細胞內新陳代謝良好的表征,而且對于早期胚胎細胞中的氧化還原電勢平衡也起到了很重要的作用,是抵御胚胎氧化損傷的重要物質基礎。在卵母細胞減數分裂成熟過程中,NADP可充當NAADP合成底物誘發鈣信號,在海星卵母細胞中也可引發鈣釋放,其具體作用機制不明。此外,NADP還可通過線粒體調節卵母細胞內鈣振蕩、維持鈣穩態。我們有充足的理由相信,NADP在卵母細胞成熟及受精激活過程中起到了至關重要的作用。然而,目前有關NADP對卵母細胞的直接影響的報道仍較少,尤其是NADP影響卵母細胞內鈣振蕩模式的作用機制仍未可知。進一步探究NADP對卵母細胞成熟、受精激活的具體作用機制有助于增進對卵母細胞發育的了解。